本发明专利技术涉及确定组分的稳定拴结结构的方法和组合物，所述稳定拴结结构可能具有多种功能和/或结合特异性。优选实施方案涉及包含一个或多个IgG抗体片段的六聚稳定拴结结构，并且该结构可以是单特异性或双特异性。所公开的方法和组合物提供了容易、通用的获得具有基本上任何功能和/或结合特异性的稳定拴结结构的途径。所述稳定拴结结构可以被施用至受治疗者用于诊断和/或治疗用途，例如用于治疗癌症或自身免疫疾病。所述稳定拴结结构可以与多种已知的效应物结合和/或轭合，所述效应物如药物、酶、放射性核素、治疗剂和/或诊断剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基于免疫球蛋白的多价生物活性装配体。
技术介绍
制备具有多种功能或结合特异性的基于抗体的试剂的现有技术存在很多限制。对于通过重组工程制备的试剂而言，此类限制可包括生产成本高、表达产率低、在血清中不稳定、在溶液中不稳定(导致形成聚集体或解离的亚基)、不确定的批组成(由于存在多种产物形式)、污染性副产物、功能活性或者结合亲和性/亲和力降低(由于空间因素或者构象改变)等。对于通过各种化学交联方法产生的试剂而言,高生产成本和纯化产物的异质性是两大限制。近年来，对抗体或可与多于一个抗原决定簇(也称为表位)结合的其他结合部分的关注日益增加。一般而言，天然存在的抗体和单克隆抗体具有两个识别相同表位的抗原结合位点。相反，双功能或者双特异性抗体(下文将仅使用术语“双特异性抗体”)是经合成或遗传改造的可与两个不同表位结合的结构。因此，同一分子构建体具有与两个不同抗原决定簇结合的能力。双特异性抗体可用于许多生物医学应用。例如，具有肿瘤细胞表面抗原和T细胞表面受体两个结合位点的双特异性抗体可引导T细胞对特定的肿瘤细胞的裂解。识别神经胶质瘤和T细胞上的CD3表位的双特异性抗体已成功用于治疗人类患者的脑肿瘤(Nitta等，Lancet.1990 ；355 =368-371)。最近，已报道称为“双特异性T细胞啮合体” (BiTE)的一类新的双特异性抗体克服了参与效应细胞募集以发挥生物活性的大多数肿瘤靶向双特异性抗体的局限(Kufer 等，Trends in Biotechnol.2004 ;22:238-244)。BiTE 是重组的双特异性单链抗体，其由导向靶细胞表面抗原和T细胞上的CD3的两个不同单链Fe片段(scFv)通过柔性多肽连接体串联连接而成(Mack等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.1995 ；92:7021-7025)。BiTE产生于哺乳动物细胞，并且与其他⑶3定向双特异性抗体相反，其能够有效地再引导人外周T淋巴细胞杀伤靶细胞，而无需任何的效应T细胞的预刺激或共刺激(Mack 等，J Immonol.1997 ；158:3965-3970 ；Loffler 等，Blood.2000 ；95:2098-2103)。已表明，低至10-100pg/mL( 0.1_2ρΜ)的BiTE浓度足以在体外实现最大靶细胞裂解的一半(Dreier 等，Int J Cancer.2002 ; 100:690-697)，而在小鼠模型中，亚微克量的 BiTE可以阻止肿瘤生长(Dreier 等，J Immunol.2003 ；170:4397-4404 ；Schlereth 等，CancerRes.2005；65:2882-2889)。已知有多种制备双特异性抗体的方法。例如，2004年2月11日提交的第20050002945号美国专利申请公布(其完整内容通过引用结合入本文)公开了双特异性和多特异性抗体的构建和使用的方法。双特异性抗体可通过四源杂交瘤方法制备，该方法包括两个不同杂交瘤的融合，每个杂交瘤产生识别不同抗原位点的单克隆抗体(Milstein和Cuello,Nature, 1983 ；305 =537-540)。融合的杂交瘤能够合成两种不同的重链和两种不同的轻链，它们可以随机缔合产生10种不同抗体结构的异质群体，其中只有一个(占总抗体分子的1/8)是双特异性的，因此必须进一步将其从其他形式中纯化出来，但是即使这方法可行，其也不具备成本效益。此外，融合的杂交瘤经常在细胞遗传学上比亲本杂交瘤更不稳定，使制备细胞系的产生更加困难。另一种制备双特异性抗体的方法使用异双功能交联剂来化学拴结两个不同的单克隆抗体，以便所得的杂交轭合物将与两个不同祀标结合(Staerz等，Nature, 1985 ；314:628-631 ；Perez等，Nature, 1985 ；316 =354-356)。通过此方法产生的双特异性抗体基本上为两个IgG分子组成的异轭合物，其缓慢扩散入组织，并且很快被从循环中清除。双特异性抗体还可通过下述方法制备:将两个亲本单克隆抗体中的每一个均还原为相应的半分子，然后将这些半分子进行混合和再氧化以获得杂种结构(hybrid structure) (Staerz和Bevan,Proc Natl Acad Sci U S A.1986 ;83:1453-1457)。替代的方法包括使用适当的连接体化学交联两个或三个单独纯化的Fab’片段。例如，欧洲专利申请0453082公开了将三马来酰亚胺化合物用于制备双特异性或三特异性抗体样结构。第6，511，663号美国专利提供了通过连接结构将三个或四·个Fab片段彼此共价连接，以制备三价和四价单特异性抗原结合蛋白的方法。所有这些化学方法均不适合商业化开发，原因是生产成本高、生产过程费力、纯化步骤多、产量低(< 20% )和产品不纯。其他方法包括提高产生杂交瘤的效率，其通过逆转录病毒衍生的穿梭载体将不同的选择标志物基因转入相应的亲本杂交瘤，然后对亲本杂交瘤进行融合(DeMonte等，ProcNatl Acad Sci U S A.1990,87 =2941-2945);或者，使用包含不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系。这些方法也面临上文讨论的不可避免的纯化问题。第5，582，996号美国专利公开了制备由来自相同或不同抗体的Fab片段组成的重组双特异性抗体的方法，所述Fab片段通过插入抗体重链恒定区区域的互补相互作用结构域缔合在一起。所述互补相互作用结构域选自互补的亮氨酸拉链或者一对肽段，一个肽段包含一系列带正电的氨基酸残基，而另一肽段则包含一系列带负电的氨基酸残基。此方法的一个限制在于:除非同时包括两个Fab亚基，否则包含融合的互补相互作用结构域的单个Fab亚基对其靶抗原的亲和力大大下降。通过重组DNA技术制备的抗体离散型Vh和\结构域可以彼此配对形成具有结合能力的二聚体(重组Fv片段)(第4，642，334号美国专利)。但是，此类非共价缔合分子在生理条件下不具有足以具备任何实际用途的稳定性。同源Vh和\结构域可用具有适当组成和长度的肽连接体(通常由超过12个的氨基酸残基组成)连接，以形成具有结合活性的单链Fv(ScFv)。制备scFv的方法参见第4，946，778号美国专利和第5，132，405号美国专利。将所述肽连接体的长度减至少于12个氨基酸残基，可防止V1^P'结构域在同一链上配对，而迫使Vh和\结构域与其他链上的互补结构域配对,从而形成功能性多聚体。用具有3至12个氨基酸残基的连接体连接的V1^P '结构域多肽链主要形成二聚体(称为二链抗体(diabody))。使用O至2个氨基酸残基的连接体则有利于形成三聚体(称为三链抗体(triabody))和四聚体(称为四链抗体(tetrabody)),但是除了连接体长度之外,低聚的精确模式还显示依赖于V-结构域的组成和方向(Vh-连接体或连接体-Vh)。已经使用由5个或更少氨基酸残基组成的肽连接体获得了多价单特异性二链抗体、三链抗体和四链抗体。双特异性二链抗体也已制得，其是由两个不同scFv组成的异型二聚体，每个scFv由通过短的肽连接体与另一抗体的\结构域连接的一个抗体的Vh结构本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有六聚稳定拴结结构的六聚复合体，其包含与两个AD2(SEQ?ID?NO：4)部分轭合的IgG抗体和四个相同或不同IgG的抗体片段，其中每个片段均与DDD2(SEQ?ID?NO：2)部分轭合；所述AD2部分与所述DDD2部分结合，其中所述复合体通过AD2部分与DDD2部分之间的二硫键被稳定，其中所述抗体片段是Fab片段并且所述AD2部分与所述IgG抗体的C末端轭合，所述DDD2部分与所述Fab片段的C?末端轭合。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张健行，大卫·高德宝，爱得盟·罗希，
申请(专利权)人：IBC医药公司，
类型：发明
国别省市：
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