一种具有细胞靶向性的磁性纳米材料及其生物医学应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有细胞靶向性的磁性纳米材料及其生物医学应用。所述磁性纳米材料能够特异性地结合组织细胞表面高表达的铁蛋白受体，能够进入细胞内。这种材料能够广谱、特异性地结合各种高表达铁蛋白受体的组织细胞，在动物模型上能够实现高效的细胞靶向性。不仅能够作为一种磁共振造影剂和荧光分子探针用于疾病诊断，而且可以作为药物的载体，用于疾病的治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于仿生合成、纳米技术、分子影像、生物医药的交叉领域。具体地说，本专利技术涉及一种具有细胞靶向性的磁性纳米材料及其生物医学应用。
技术介绍
磁共振成像(MRI)具有无伤害性、分辨率高的独特优势，因而是一个非常好的影像工具来用于疾病的早期诊断。但是其灵敏度低，无法很好地与区分病变组织与正常组织，检测没有特异性，这些都是MRI固有的一些缺点[Terreno et al.，2010]。为了克服灵敏度低的这个缺点，研究人员尝试合成各种MRI造影剂(contrast agent,又称对比剂)来缩短纵向弛豫时间(longitudinal relaxation time, T1)或者横向弛豫时间(transverserelaxation time, T2)来增强磁共振的灵敏度和组织对比度。MRI造影剂弛豫时间可以划分为T1造影剂和T2造影剂。T1造影剂通过缩短T1来增强信号强度，在T1加权图像上使得目标区域变亮。这类造影剂大多是利用镧系金属元素钆(Gd)或者其衍生的材料，它们是现在临床上应用最为广泛的MRI造影剂，但是经过近30年的临床使用，钆基造影剂出现了诸多缺陷，如灵敏度低、半衰期短和副作用大。例如，2007年和2010年美国FDA相继发出通告，钆基造影剂给特定肾病患者导致致命的肾源系统性纤维化(FDA news release,FDA RequestsBoxed Warning for Contrast Agents Used to Improve MRI Images,5/23/2007;FDA newsrelease, FDA:New warnings required on use of gadolinium-based contrast agents,9/9/2010)。T2造影剂主要是超顺磁铁氧化物(SPIO)颗粒，当磁共振成像仪采用T2和T/加权成像序列时，使得SPIO所在的区域质子信号降低，在图像上表现为暗信号。与传统的Gd基造影剂相比，SPIO颗粒具有以下优点:(1)灵敏度高:每个金属单元都可以最大程度地改变MRI信号强度，尤其是在T/加权图像上，可显著地提高信噪比(SNR) ；(2)体内可代谢清除:铁在生物体内是可以代谢的，超顺磁性磁铁矿的铁可用于机体的铁循环；(3)易于进行表面修饰，可以连接不同的功能团和配体；(4)进入生物体内，它还可以通过光学显微镜以及电子显微镜进行观察；(5)它们能够通过化学合成条件去改变粒径、形状等因素来调控它们的磁学性质和弛豫效能，因而SPIO颗粒是一种很有发展前途的MRI造影剂[Bulte andKraitchman, 2004]。另外，磁性纳米材料具有比表面积大、装载效率闻和磁化率闻等特性，因而是优良的药物载体，它可延长药物作用时间，增强药物效应，减轻毒副反应，提高药物的稳定性，防止不稳定药物降解。因此，磁性纳米材料已经成为高效药物运载系统的一个理想选择，有望克服传统的化学治疗药物给药方式剂量大、毒副作用强、效率低、稳定性差等缺陷。然而，传统的磁性纳米材料都是通过物理化学方法合成，尽管合成方法已经发展多年，但是迄今为止没有任何一种方法能够同时合成具有粒径形状均一、高分散性、亲水性和高生物相容性这些特性为一体的磁性纳米材料，通常的磁性纳米材料合成需要剧烈的物理化学条件(高温、高压、高PH)，合成后需要昂贵、繁琐复杂的表面修饰，才能保证磁性纳米材料的高分散性、亲水性和生物相容性。另外，在磁性纳米材料的生物医学应用方面，物理化学合成的磁性纳米材料对细胞没有特异的靶向性，进入体内后容易被网状内皮系统(reticuloendothelia system, RES)吞卩遼，为了实现体内的特定细胞革巴向性,传统的磁性纳米材料必须通过复杂的表面修饰和连接对特定细胞(如肿瘤细胞)有特异性的配体，如抗体、妝段、祀向性小分子等[Harisinghani et al., 2003;Lin et al., 2010;McCarthy etal.，2007]。然而，传统的依靠化学表面修饰和偶联靶向配体的磁性纳米材料存在着诸多不足；(I)修饰和连接靶向配体步骤复杂，且很难定量和保证均匀性；(2)磁性纳米材料经过修饰后，往往会改变其粒径和表面特性等特征；(3)对病灶组织的靶向亲和性低，仍然大量被网状内皮系统吞噬(这类材料的最大缺点)；(4)另外进入体内后往往还存在稳定性的问题，如磁性纳米材料表面连接的靶向多肽进入体内后，容易产生非特异性吸附，被蛋白酶降解，通常需要在其表面连接多个靶向分子或者加入D-氨基酸来防止降解，因而无法实现疾病的早期诊断和治疗[Byrne et al., 2008;Lee et al., 2007;McCarthy et al.，2010]。当磁性纳米材料的传统物理化学合成遇到高耗能、难修饰等问题时，自然界的生物矿化作用和生物仿生合成为磁性纳米材料的合成提供了另外一条思路。生物矿化作用是指通过基因或生物大分子的调控在生理条件下形成无机矿物的过程。生物仿生合成是指在理解生物矿化机理的基础上，模仿生物矿化中无机物在有机物调制下形成过程的无机材料合成，使得其所形成的材料具有均一的尺寸、特定的组装结构和特定的生物大分子膜所包被。生物仿生合成只需简单步骤、绿色低耗能就能够同时合成具有粒径形状均一、高分散性、亲水性和高生物相容性的磁性纳米材料。其中铁蛋白和趋磁细菌Mms6蛋白仿生合成超顺磁磁性材料是典型代表。铁蛋白，是参与和维持生物有机体铁代谢的重要铁储存蛋白，广泛存在于动植物及微生物细胞中。它们具有典型的核一壳型纳米结构:内核为水合氧化铁颗粒(6-8nm)，外壳由24个蛋白亚基自组装构成的笼状蛋白壳(12nm)。铁蛋白壳的形成受生物体基因高度控制，粒径、形状极其均一，为仿生制备超细SPIO颗粒提供了天然的生物纳米反应器[Harrison and Arosio, 1996;Uchida et al.2007]。更为重要的是，许多快速生长的细胞(如肿瘤细胞)，需要大量的铁元素营养，都高表达铁蛋白受体。Fargion等人用人白血病癌细胞K562、HL-60细胞系和小细胞肺癌细胞NC1-417对人的全重链(H)亚基铁蛋白、全轻链(L)亚基铁蛋白 以及它们的杂合体铁蛋白进行了结合实验研究，结果表明K562细胞能特异性地结合人H亚基铁蛋白和人H、L杂合体铁蛋白。结合人铁蛋白的结合常数Ka高达3 X IO8M^1 [Fargion et al.，1988]。Moss等对高度增殖的肿瘤细胞和正常细胞上的人H亚基铁蛋白特异性受体进行了研究，发现肿瘤细胞上高度表达人H亚基铁蛋白特异性受体，而正常细胞几乎检测不到这种受体的表达[Moss et al.，1992]。最近，Li等的实验研究发现:人转铁蛋白受体I (TfRl)是一个人H亚基铁蛋白和转铁蛋白的共受体，能够特异性地结合人H亚基铁蛋白，并将其内吞进入内含体和溶酶体[Li et al.，2010]。当机体处于炎症过程中，会分泌大量的炎症因子，从而刺激炎症细胞高表达铁蛋白受体，以维持大量的铁源需要[Fahmy and Young, 1993; Byrd and Horwitz, 2007] 天然铁蛋白的内核是磁化率低(弱磁性)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物在制备成像定位诊断试剂和治疗物质中的应用。

【技术特征摘要】
2012.01.19 CN 201210018276.31.一种蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物在制备成像定位诊断试剂和治疗物质中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述成像定位诊断试剂选自磁共振造影剂或分子探针。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的磁共振造影剂或分子探针含有所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或衍生物。4.如权利要求1所述的蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物，其特征在于，所述的磁性纳米颗粒或其衍生物的内核的成分为含有金属元素的化合物，所述金属元素选自钆、猛、铁、钴和/或镍元素。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物的蛋白壳可以特异性地与组织或细胞表面表达的受体结合。6.如权利要求5所述 的应用,其特征在于,所述蛋白壳选自铁蛋白(ferritin)、伴侣蛋白、DNA结合蛋白、趋磁细菌的磁小体膜蛋白或具有纳米空腔结构的病毒蛋白壳。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述铁蛋白包括天然铁蛋白和基因工程重组铁蛋白，其中天然铁蛋白来源于真核生物或原核生物，基因工程重组铁蛋白包括重组铁蛋白的全重(H)链亚基铁蛋白、全轻(L)链亚基铁蛋白、重组铁蛋白的重链和轻链以任意比例自组装的铁蛋白、以及这些蛋白亚基的突变体或融合蛋白。8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物通过下述步骤制备得到: (a)以重组人铁蛋白为1旲板，将人铁蛋白的H亚基和L亚基的全长cDNA分别克隆和构建到pETllb质粒上； (b)将含有人铁蛋白H亚基和L亚基的重组质粒分别转化或者共转化细胞BL21(DE3)plysS，加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷激活Τ7启动子，诱导表达； (c)表达结束后进行超声破碎释放蛋白； (d)对蛋白进行分离和纯化； (e)将形成内核成分的金属盐类和氧化剂加入重组人铁蛋白的溶液中进行反应，控制PH值为7-11，控制温度为25-80 V，在重组人铁蛋白内部形成强磁性的纳米颗粒；形成内核成分的盐类的浓度为每次加入的金属元素原子数与蛋白分子数之比在10-200之间，使每个蛋白分子加入的金属元素原子数可在100-15000之间；氧化剂的浓度为每次加入氧化剂的分子数与加入金属元素离子的原子数之比为2:1或3:1 ;蛋白浓度>0.25mg/ml ; (f)排阻或离子交换层析进行分离，离心和分子筛或阴离子交换层析纯化后得到所述蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(e)控制pH值为8-9。10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(e)控制温度为35-70°C。11.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述形成内核成分的金属盐类选自亚铁盐、铁盐、钆盐、锰盐、钴盐和/或镍盐。12.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述金属元素选自钆、锰、铁、钴和/或镍元素。13.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述氧化剂选自过氧化氢、氧气、或通过反应可以产生过氧化氢或氧气的物质。14.如权利要求8所述的应用，其特征在于，每个蛋白分子加入的金属元素原子数在140-10000 之间。15.如权利要求8所述的应用，其特征在于，每个蛋白分子加入的钆原子数在100-200，和/或每个蛋白分子加入的铁原子数在500-10000之间。16.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗物质为治疗表达铁蛋白受体的疾病的物质。17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述物质连接有包裹磁性纳米颗粒的蛋白壳。18.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述物质选自化疗药物、放射性同位素、细胞因子、核酸、抗癌或抗炎症药物。19.如权利要求16-18任一所述的应用，其特征在于，所述的表达铁蛋白受体的疾病为肿瘤和/或炎症。20.如权利要求19所述的应用，所述的肿瘤选自肝癌、白血癌、神经胶质瘤、肺癌、结肠癌、胰腺癌或乳腺癌。21.一种蛋白壳包裹的磁性纳米颗粒或其衍生物在制备用于诊断表达铁蛋白受体的疾病的磁性造影剂和分子探针中的应用 。22.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述的表达铁蛋白受体的疾病为肿瘤、和/或炎症。23.如权利要求22所述的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘永信，曹长乾，田兰香，蔡垚，朱日祥，
申请(专利权)人：中国科学院地质与地球物理研究所，
类型：发明
国别省市：