本发明专利技术公开了一种利用香蕉生物酶法生产γ-氨基丁酸的方法，将香蕉切碎研磨，每1kg香蕉中加入1～3L浸提液，均匀搅拌后在4～25℃条件下静置提取3～5h；5000～7000rpm离心5～10min后，得谷氨酸脱羧酶粗酶液；1L酶液中加入30～50g谷氨酸及谷氨酸钠（pH值4.5～6.0），37℃条件下12～24h即可转化完全；加入0.1%～3.0%活性炭搅拌30～60min，过滤，旋蒸结晶得20～40gγ-氨基丁酸。该生产工艺简单、反应专一、成本低、产率高、纯度好、周期短、浸提液可反复使用、废弃物少、环保，适合工业化生产。
Method for producing gamma aminobutyric acid by using banana biological enzyme method
The invention discloses a method for using banana enzymatic production of GABA, bananas will grind to each 1kg banana 1 ~ 3L in the leaching liquor, stir in 4 ~ 25 DEG C under the condition of static extraction of 3 ~ 5h; 5000 ~ 7000rpm 5 ~ 10min after centrifugation, to glutamic acid decarboxylation enzyme; adding 30 ~ 50g glutamic acid and sodium glutamate 1L enzyme (pH = 4.5 ~ 6), the temperature of 37 DEG C for 12 ~ 24h can be completely transformed; adding 0.1% ~ 3% activated carbon filtration, stirring for 30 ~ 60min, 20 ~ 40g evaporation crystallization of gamma aminobutyric acid. The production process is simple, the reaction is specific, the cost is low, the yield is high, the purity is good, the cycle is short, the leaching solution can be used repeatedly, the waste is little, and the utility model is suitable for industrial production.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物转化酶法合成
，具体涉及利用香蕉生物酶法生产Y -氨基丁酸的方法。
技术介绍
谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)广泛存在于原核和真核生物中，是一种胞内酶，主要存在于细胞质中，与辅因子磷酸吡哆醛(PLP)结合催化谷氨酸转化为Y-氨基丁酸和C02。在植物中，GAD的C末端具有特殊的与钙调蛋白(CaM)结合的区域，能够与CaM结合并增加酶的活力。香蕉谷氨酸脱羧酶的分子量为56kD，香蕉谷氨酸脱羧酶基因cDNA的ORF全长1500bp，编码499个氨基酸。γ -氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)分子式为 C4H9NO2,是一种天然的非蛋白质的游离氨基酸活性成分，广泛分布于动植物体内。植物如豆属、参属以及一些中草药等的种子和根茎中都含有GABA。在动物体内，GABA几乎只存在于神经组织中，其中脑组织中的含量大约为0.1 0.6mg/g组织，免疫学研究表明，大脑黑质中的GABA浓度最高。GABA可以与GABAA受体、GABAB受体、GABAC受体3种不同受体结合，导致细胞膜离子通透性变化，会产生不同的调节性影响。研究表明GABA具有降血压、抗焦虑、降低血氨、抗癫痫、调节免疫、改善脂质代谢、防止动脉硬化、减肥、促进乙醇代谢、防止皮肤老化、消除体臭、健脑益智等功能，能够用作尿毒症、睡眠障碍以及CO中毒的治疗药物。GABA可以开发为保健食品，也可以开发为具有显著药理作用的药物，前景非常乐观，因而GABA正越来越引起人们的关注。然而GABA天然存在量低，且从动植物组织中大量提取分离难度非常大，目前已知的制取GABA的方法有化学合成法、微生物发酵法、植物富集法和酶法。一、化学合成法主要有:(1)通过Y-氯丁氰的取代水反应来合成，将邻苯二甲酰亚氨钾与Y-氯丁氰在180°C反应，然后将产物与浓硫酸回流，再结晶提纯而得；(2)由吡咯烷酮经氢氧化钙、碳酸氢铵水解开环制得；(3)以丁内酯为起始原料，经过氯化酯化反应，生成4-氯丁酸甲酯，再经氨解和皂化反应制得GABA。化学合成方法条件剧烈，且有化学物质残留，成本较高，主要应用于化工和医药领域，不适合在食品中应用。二、微生物发酵法主要是用筛选法或者基因重组法得到具有高GAD活性的大肠杆菌、曲霉和乳酸菌等微生物来发酵生产GABA。微生物发酵法生产周期较长，副反应多，分离纯化较复杂。三、植物富集法主要是用含米胚芽的糙米或者米糠、辣椒、蜜柑、番茄、南瓜、茄子、豆芽等来生产富含GABA食品等。此法可使水果蔬菜等的加工深度得到提升，提闻水果蔬菜等的附加值，但加工复杂。四、酶法主要有两种:(1)将微生物中的GAD提取后得到的粗酶液或者纯酶液作用于谷氨酸生产GABA ；(2)将植物中的GAD提取后得到的粗酶液或者纯酶液作用于谷氨酸生产GABA。酶法生产GABA具有周期短、副反应少、纯度高等优点。近年来，GABA的生理作用被不断发现，其应用也越来越广泛。研究开发低成本且适合大规模工业化生产食品药品级GABA的技术方法，意义重大。本专利技术就是基于此背景诞生的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从香蕉中提取谷氨酸脱羧酶用来制备Y-氨基丁酸的生产方法，该生产方法成本低、周期短、适于大规模工业化生产食品药品级Y-氨基丁酸。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下:一种利用香蕉生物酶法生产Y-氨基丁酸的方法，包括以下步骤: (O将香蕉切碎研磨，然后在每Ikg所述香蕉中加入I 3L浸提液，均匀搅拌后，于4 25°C静置提取3 5h，接着5000 7000rpm离心5 lOmin，所得上清液即为香蕉谷氨酸脱羧酶粗酶液，所述浸提液采用Η20、0.05 0.lmol/L Na2HP04/NaH2P04、0.I 0.2mol/L NaCl、10 40mg/L CaCl2 以及 0.1 0.Smmol /I,维生素 B6 或者 0.1 0.Smmol /I,憐酸吡哆醛配制而成，并保持pH值4.5 6.0，所述浸提液中的维生素B6或者磷酸吡哆醛能够缓解所述谷氨酸脱羧酶粗酶液的氧化； (2)在上述步骤(I)制得的每IL谷氨酸脱羧酶液中加入10 30g/L谷氨酸及谷氨酸钠溶液0.5 1.0L，控制pH值在4.5 6 .0，于25 40°C，50 200r/min搅拌反应I 4h后，然后每隔0.5 2h分批添加I 5g谷氨酸及谷氨酸钠继续反应，直至谷氨酸脱羧酶活性消失； 或者，在上述步骤(I)制得的每IL谷氨酸脱羧酶液中加入30 50g谷氨酸或谷氨酸钠，控制pH值在4.5 6.0，于25 40°C，50 200r/min搅拌反应12 24h ； (3)步骤(2)反应完成后，在反应液中加入0.1% 3.0% (w/v)活性炭于25 80°C、50 200r/min条件下揽拌脱色30 60min ； 或者，将步骤(2)反应完成的反应液旋蒸至原反应液体积一半后,加入0.1 3.0% (w/V)活性炭于25 80°C、50 200r/min条件下搅拌脱色30 60min ； (4)然后将步骤(3)的脱色液趁热过滤，过滤液40 80°C旋蒸至原过滤液体积的10 30%后，4 25°C冷却，重结晶，则得到Y -氨基丁酸。在步骤(2)中，所述谷氨酸脱羧酶活性的测定采用Berthelot反应原理。在步骤(I)前，设置香蕉成熟过程中测定谷氨酸脱羧酶酶活的步骤，使用的香蕉为国产或者进口的能食用的香蕉，从香蕉果肉中或连皮带果肉中提取谷氨酸脱羧酶进行测定，该测定采用Berthelot反应原理。测定所述谷氨酸脱羧酶活性的方法包括:首先将200 μ L 0.1mol谷氨酸或谷氨酸钠溶液和100 μ L待测谷氨酸脱羧酶液在30°C反应0.5h，然后将反应液置于冰浴中，并加入200 μ L 0.2 mol/L pH 9.0的硼酸缓冲液终止反应，再加入1.0mL 6%苯酚和400 μ L次氯酸钠溶液，充分振荡后，在沸水浴中反应10 min，然后迅速在冰浴中冷却20 min，于分光光度计上在630nm处测定吸光值。在步骤(2)中，所述谷氨酸、谷氨酸钠采用分批添加的方式。由于上述技术方案的运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点:从香蕉中提取谷氨酸脱羧酶，催化谷氨酸或谷氨酸钠转化为Y -氨基丁酸并提纯出，该酶法生产工艺简单，操作方便，反应专一，成本低，产率高，纯度好，周期短，浸提液可反复使用，废弃物少，环保，能够大规模生产出Y-氨基丁酸，满足对食品药品级Y-氨基丁酸的需求。附图说明 图1是4°c储存条件下香蕉谷氨酸脱羧酶活性变化 图2是25 °C储存条件下香蕉谷氨酸脱羧酶活性变化 图3是37 °C储存条件下香蕉谷氨酸脱羧酶活性变化图。具体实施例方式下面进一步阐述本专利技术。本专利技术中使用的原料是国产或者进口的能食用的香蕉、谷氨酸和谷氨酸钠。实施例1(1)配置浸提液:0.05mol/L Na2HP04/NaH2P04,0.15mol/L NaCl.0.2mmol/L 维生素 B6 或者磷酸吡哆醛 PLP、30mg/L CaCl2, pH 值 5.7 ; (2)将成熟的整根香蕉(连皮带果肉)切碎研磨，每Ikg香蕉中加入2L浸提液，搅拌均匀，于室温静置提取本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用香蕉生物酶法生产γ?氨基丁酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将香蕉切碎研磨，然后在每1kg所述香蕉中加入1～3L浸提液，均匀搅拌后，于4～25℃静置提取3～5h，接着5000～7000rpm离心5～10min，所得上清液即为香蕉谷氨酸脱羧酶粗酶液，所述浸提液采用H2O、0.05～0.1mol/L?Na2HPO4/NaH2PO4、0.1～0.2mol/L?NaCl、10～40mg/L?CaCl2以及0.1～0.5mmol/L维生素B6或者0.1～0.5mmol/L磷酸吡哆醛配制而成，并保持pH值4.5～6.0，所述浸提液中的维生素B6或者磷酸吡哆醛能够缓解所述谷氨酸脱羧酶粗酶液的氧化；（2）在上述步骤（1）制得的每1L谷氨酸脱羧酶液中加入10～30g/L谷氨酸及谷氨酸钠溶液0.5～1.0L，控制pH值在4.5～6.0，于25～40℃，50～200r/min搅拌反应1～4h后，然后每隔0.5～2h分批添加1～5g谷氨酸及谷氨酸钠继续反应，直至谷氨酸脱羧酶活性消失；或者，在上述步骤（1）制得的每1L谷氨酸脱羧酶液中加入30～50g谷氨酸或谷氨酸钠，控制pH值在4.5～6.0，于25～40℃，50～200r/min搅拌反应12～24h；（3）步骤（2）反应完成后，在反应液中加入0.1％～3.0%（w/v）活性炭于25～80℃、50～200r/min条件下搅拌脱色30～60min；或者，将步骤（2）反应完成的反应液旋蒸至原反应液体积一半后，加入0.1～3.0%（w/v）活性炭于25～80℃、50～200r/min条件下搅拌脱色30～60min；（4）然后将步骤（3）的脱色液趁热过滤，过滤液40～80℃旋蒸至原过滤液体积的10～30%后，4～25℃冷却，重结晶，则得到γ?氨基丁酸。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：殷志敏，王期，孙洪露，温尧林，
申请(专利权)人：苏州凯祥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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