甜菊糖苷的重组生产制造技术

本文公开了经过改造能够表达编码甜菊醇生物合成酶和UDP-糖基转移酶(UGTs)的新型重组基因的重组微生物、植物和植物细胞。这些微生物、植物或植物细胞可以产生甜菊醇或甜菊糖苷(例如甜叶悬钩子苷或莱鲍迪苷A)，作为食品中的天然甜味剂和膳食补充剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及甜菊醇(steviol)和甜菊糖苷(steviol glycoside)的重组制备。具体来说，本公开涉及通过诸如重组微生物、植物或植物细胞的重组宿主制备甜菊醇和甜菊糖苷，比如甜叶悬钩子苷(rubusoside)和/或莱鲍迪苷(rebaudioside) A。本公开还提供了含有所述甜菊糖苷的组合物。
技术介绍
甜味剂是常用于食品、饮料或糖果业的为人熟知的成分。甜味剂既可以用于在生产过程中加入最终食品，也可以在适当稀释的情况下作为佐餐甜味剂或者作为烘培中糖的家用替代品来单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(比如蔗糖、高果糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)和人工甜味剂(比如阿斯巴甜、糖精和蔗糖素)。甜菊提取物(stevia extract)是可以从常青灌木甜叶菊(Stevia rebaudiana)中分离和提取的一种天然甜味剂。甜菊在南美和亚洲被广泛种植用于商业生产甜菊提取物。纯化程度各不相同的甜菊提取物常常被作为食品中的高甜度甜味剂，或者混合或单独作为佐餐甜味剂。`甜菊植物(Stevia plant)的提取物含有莱鲍迪苷和其它带来甜味的甜菊糖苷，虽然不同产品批次之间每种糖苷的量往往不同。现有的商品中占优势的是莱鲍迪苷A，和量少一些的其它糖苷，比如莱鲍迪苷C、D和F。甜菊提取物还可能含有杂质，比如造成异味的来源于植物的化合物。这些异味根据食物系统或者目标用途会带来或多或少的问题。潜在的杂质包括色素、脂类、蛋白、酚类、糖类、斯巴醇和其它倍半萜烯、半日花烷型二萜类、单萜烯、癸酸、8，11，14- 二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八醇、豆留醇、β -谷留醇、α -和β -香树素、羽扇豆醇酯、β -香树脂醇乙酸乙酯、五环三萜、centauredin、quercitin、ep1- α -杜松醇、carophyllenes 和衍生物、β -松油職、β -谷留醇和赤霉素。专利技术概述本文提供了诸如微生物的重组宿主，所述重组宿主包含一或多个生物合成基因，这些基因的表达导致甜菊醇的产生。这类基因包括编码柯巴基焦磷酸合酶的基因、编码异贝壳杉烯合酶的基因、编码异贝壳杉烯氧化酶的基因，和编码甜菊醇合成酶的基因。重组宿主可以包含编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因代替编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因。这些基因中至少一个是重组基因。在一些实施方案中，重组宿主还包含编码香叶基香叶基(geranylgeranyl)焦磷酸合酶的基因。重组宿主还可以包含编码截短的HMG-CoA还原酶的基因和/或编码CPR的基因。这些基因中一或多个的表达可以是诱导性的。本文本一个方面提供了重组宿主，所述重组宿主包含编码UGT91D2多肽(例如UGT91D2e或UGT91D2m多肽)的重组基因。UGT91D2多肽与SEQ ID NO:5中给出的氨基酸序列可以有至少90%的同一性(例如，至少95%或99%同一性)。UGT91D2多肽可以包含位于 SEQ ID NO:5 的残基 1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380或387-473的至少一个氨基酸取代。例如，UGT91D2多肽包含位于选自SEQ ID NO:5的残基 30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427 和438中的一或多个残基的氨基酸取代。在一个实施方案中，UGT91D2多肽包含相对SEQ IDNO:5位于残基位点206的精氨酸、残基位点207的半胱氨酸。在一个实施方案中，UGT91D2多肽包含相对SEQ ID NO:5位于残基位点30的苯丙氨酸、残基位点93的谷氨酰胺、残基位点99的缬氨酸、残基位点122的苯丙氨酸、残基位点140的酪氨酸、残基位点142的半胱氨酸、残基位点148的苏氨酸、残基位点153的丙氨酸、残基位点156的丝氨酸、残基位点195的甲硫氨酸、残基位点196的谷氨酸、残基位点199的谷氨酸、残基位点211的甲硫氨酸、残基位点221的苯丙氨酸、残基位点286的丙氨酸、残基位点427的天冬酰胺或者残基位点438的丙氨酸。多肽可以具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:95的氨基酸序列。本文描述的宿主还包含编码与SEQ ID NO:3给出的氨基酸序列有至少90%同一性的UGT85C多肽的重组基因。例如，UGT85C多肽可以包含位于SEQ ID勵:3的残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。本文描述的宿主还包含编码与SEQ ID NO:7给出的氨基酸序列有至少90%同一性的UGT76G多肽的重组基因。例如，UGT76G多肽可以包含位于SEQ ID NO:7的残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331 和 346 的一或多个氨基酸取代。本文本还提供了包含重组基因的重组宿主，所述重组基因编码的UGT85C多肽与SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列有至少90%同一性，并且有位于SEQ ID NO:3中的残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。例如，UGT85C多肽可以包含位于SEQ ID NO:3的残基13、15、60、270、289和418的取代。例如，UGT85C多肽可以包含a)位于SEQ ID NO:3的残基13、60和270的取代；b)位于SEQ ID NO:3的残基60和87的取代；c)位于SEQ ID NO:3的残基65、71、220、243和270的取代；d)位于SEQ ID NO:3的残基 65、71、220、243、270 和 441 的取代；e)位于 SEQ ID NO:3 的残基 65、71、220、389 和 394的取代；f)位于SEQ ID NO:3的残基65、71、270和289的取代；g)位于SEQ ID NO:3的残基15和65的取代；h)位于SEQ ID NO:3的残基65和270的取代；i)位于SEQ ID NO:3的残基65和440的取代；j)位于SEQ ID NO:3的残基65和441的取代；k)位于SEQ ID NO:3的残基65和418的取代；1)位于SEQ ID NO:3的残基220、243、270和334的取代；或者m)位于SEQ ID NO:3的残基270和289的取代。本文本另一方面提供了包含重组基因的重组宿主，所述重组基因编码的UGT76G多肽与SEQ ID NO:7给出 氨基酸序列有至少90%同一性，并且有位于SEQ ID N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.02 US 61/350,553;2011.01.20 US 61/434,582;1.重组宿主，其包含编码UGT91D2多肽的重组基因。2.权利要求1所述的重组宿主，其中所述UGT91D2多肽是UGT91D2e或UGT91D2m。3.权利要求1或2所述的重组宿主，其中所述UGT91D2多肽与SEQIDN0:5中给出的氨基酸序列有至少90%的同一性。4.权利要求3所述的重组宿主，其中所述UGT91D2多肽与SEQID NO:5中给出的氨基酸序列有至少95%的同一性。5.权利要求4所述的重组宿主，其中所述UGT91D2多肽与SEQID NO:5中给出的氨基酸序列有至少99%的同一性。6.权利要求1-5中任一项所述的宿主，其中所述宿主是微生物。7.权利要求6所述的宿主，其中所述微生物是糖酵母属微生物。8.权利要求6所述的宿主，其中所述糖酵母属微生物是酿酒酵母。9.权利要求6所述的宿主，其中所述微生物是大肠杆菌。10.权利要求1-5中任一项所述的宿主，其中所述宿主是植物或植物细胞。11.权利要求10所述的宿主，其中所述植物或植物细胞是甜菊、中欧葫芦藓或烟草植物或植物细胞。12.权利要求11所述的宿主，其中所述甜菊植物或植物细胞是甜叶菊植物或植物细胞。13.权利要求1-12中任一项所述的宿主，其中所述多肽包含位于SEQIDNO: 5中残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380 或 387-473 的至少一个氨基酸取代。14.权利要求1-13中任一项所述的宿主，其中所述多肽包含位于SEQIDN0:5中选自残基 30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427 和438的一或多个残基的氨基酸取代。15.权利要求14所述的宿主，其中所述多肽相对SEQID NO:5包含位于残基206的精氨酸，位于残基207的半胱氨酸和位于残基343的精氨酸。16.权利要求14所述的宿主，其中所述多肽相对SEQID NO:5包含位于残基30的苯丙氨酸、残基93的谷氨酰胺、残基99的缬氨酸、残基122的苯丙氨酸、残基140的酪氨酸、残基142的半胱氨酸、残基148的苏氨酸、残基153的丙氨酸、残基156的丝氨酸、残基195的甲硫氨酸、残基196的谷氨酸、残基199的谷氨酸、残基211的甲硫氨酸、残基221的苯丙氨酸、残基286的丙氨酸、残基427的天冬酰胺或者残基438的丙氨酸。17.权利要求1-15中任一项所述的宿主，其中所述多肽包含SEQIDNO:95的氨基酸序列。18.权利要求1-12中任一项所述的宿主，其中所述多肽包含SEQID N0:5的氨基酸序列。19.权利要求1-18中任一项所述的宿主，所述宿主还包含编码与SEQIDN0:3给出的氨基酸序列有至少90%同一性的UGT85C多肽的重组基因。20.权利要求19所述的宿主，其中所述UGT85C多肽包含位于SEQIDN0:3的残基9、10、`13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、`418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。21.权利要求1-20中任一项所述的宿主，所述宿主还包含编码与SEQIDNO:7给出的氨基酸序列有至少90%同一性的UGT76G多肽的重组基因。22.权利要求21所述的宿主，所述UGT76G多肽包含位于SEQID NO:7的残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331 和 346 的一或多个氨基酸取代。23.重组宿主，所述宿主包含的重组基因编码的UGT85C多肽与SEQIDNO:3中给出的氨基酸序列有至少90%同一性，并且有位于SEQ ID NO:3中的残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。24.权利要求23所述的宿主，其中所述多肽包含位于SEQID NO:3的残基13、15、60、270,289和418的取代。25.权利要求23所述的宿主，其中所述多肽包含a)位于SEQID NO:3的残基13、60和270的取代；b)位于SEQ ID NO: 3的残基60和87的取代；c)位于SEQ ID NO: 3的残基65、71、220、243 和 270 的取代；d)位于 SEQ IDNO:3 的残基 65、71、220、243、270 和 441 的取代；e)位于SEQ ID NO: 3的残基65、71、220、389和394的取代；f)位于SEQ ID NO: 3的残基65、71、270和289的取代；g)位于SEQ ID NO: 3的残基15和65的取代；h)位于SEQID NO:3的残基65和270的取代；i)位于SEQ ID NO:3的残基65和440的取代；j)位于SEQ ID NO: 3的残基65和441的取代；k)位于SEQ IDNO: 3的残基65和418的取代；1)位于SEQ ID NO: 3的残基220、243、270和334的取代；或者m)位于SEQ ID NO: 3的残基270和289的取代。26.重组宿主，其包含的重组基因编码的UGT76G多肽与SEQID N0:7给出的氨基酸序列有至少90%同一性，并且有位于SEQ ID NO:7中残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、 194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331和346的一或多个氨基酸取代。27.权利要求26所述的宿主，其中所述多肽含有a)位于氨基酸残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208 和 291的取代；b)位于残基 74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285 和 291 的取代；或者 c)位于残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331 和 346 的取代。28.权利要求23-27中任一项所述的宿主，其中所述宿主是微生物。29.权利要求28所述的宿主，其中所述微生物是糖酵母属微生物。30.权利要求29所述的宿主，其中所述糖酵母属微生物是酿酒酵母。31.权利要求28所述的宿主，其中所述微生物是大肠杆菌。32.权利要求23-27中任一项所述的宿主，其中所述宿主是植物或植物细胞。33.权利要求32所述的宿主，其中所述植物或植物细胞是甜菊、中欧葫芦藓或者烟草植物或植物细胞.34.权利要求33所述的宿主，其中所述甜菊植物或植物细胞是甜叶菊植物或植物细胞。35.权利要求1-34中任一项所述的宿主，所述宿主还包含编码UGT74G1多肽的基因。36.权利要求35所述的宿主，其中所述编码所述UGT74G1多肽的基因是重组基因。37.权利要求1-36中任一项所述的宿主,所述宿主还包含下述中的一或多个: (i)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因； ( )编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因，或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因； (iii)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因；和 (iv)编码甜菊醇合成酶的基因。38.权利要求1-37中任一项所述的宿主，所述宿主还包含下述中的一或多个: (V)编码截短的HMG-CoA的基因； (vi)编码CPR的基因； (vii)编码鼠李糖合成酶的基因； (viii)编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因；和 (ix)编码UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因。39.权利要求38 所述的宿主,其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)、(vii)、(viii)或(ix)中的至少一个基因是重组基因。40.权利要求37所述的宿主，其中和(iv)中的每个基因都是重组基因。41.分离的核酸，其编码与SEQID NO:5给出的氨基酸序列有至少90%同一性的多肽。42.权利要求41所述的核酸，其中所述多肽与SEQID NO:5给出的氨基酸序列有至少95%同一性。43.权利要求41或42所述的核酸，其中所述多肽与SEQID NO: 5给出的氨基酸序列有至少99%同一性。44.权利要求41-43中任一项所述的核酸，其中所述多肽包含位于SEQIDN0:5中残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380 或 387-473 的至少一个氨基酸取代。45.权利要求41-44中任一项所述的核酸，其中所述多肽包含位于SEQIDN0:5中选自残基 30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427和438中的一或多个残基的氨基酸取代。46.权利要求41-45中任一项所述的核酸,其中所述多肽包含位于SEQIDNO: 5中残基206的精氨酸、残基207的半胱氨酸和残基343的精氨酸。47.权利要求41-45中任一项所述的核酸，其中所述多肽包含位于SEQIDNO: 5的残基位点30的苯丙氨酸、残基位点93的谷氨酰胺、残基位点99的缬氨酸、残基位点122的苯丙氨酸、残基位点140的酪氨酸、残基位点142的半胱氨酸、残基位点148的苏氨酸、残基位点153的丙氨酸、残基位点156的丝氨酸、残基位点195的甲硫氨酸、残基位点196的谷氨酸、残基位点199的谷氨酸、残基位点211的甲硫氨酸、残基位点221的苯丙氨酸、残基位点286的丙氨酸、残基位点427的天冬酰胺或者残基位点438的丙氨酸。48.分离的多肽，其具有与SEQID NO:5的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列。49.重组宿主，所述宿主包含: (i)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因； ( )编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因，或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因； (iii)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因；和 (iv)编码甜菊醇合成酶的基因； 其中所述基因中的至少一个是重组基因。50.权利要求49所述的宿主，其中所述宿主被培养在每个所述基因都能得以表达的条件下时产生甜菊醇。51.权利要求50所述的宿主，其中当培养在所述条件下时，所述甜菊醇累积到至少lmg/L培养基。52.权利要求49-51中任一项所述的宿主，其中所述香叶基香叶基焦磷酸合酶与SEQID NOs: 121-128之一给出的氨基酸序列有90%以上的序列同一性。53.权利要求49-52中任一项所述的宿主，其中所述柯巴基焦磷酸合酶与SEQIDNOs: 129-131之一给出的氨基酸序列有90%以上的序列同一性。54.权利要求49-53中任一项所述的宿主，其中所述异贝壳杉烯合酶与SEQIDNOs: 132-135之一给出的氨基酸序列有90%以上的序列同一性。55.权利要求49-54中任一项所述的宿主，其中所述异贝壳杉烯氧化酶与SEQIDNOs: 138-141之一给出的氨基酸序列之一有90%以上的序列同一性。56.权利要求49-55中任一项所述的宿主，其中所述甜菊醇合成酶与SEQIDNOs: 142-146之一给出的氨基酸序列之一有90%以上的序列同一性。57.权利要求49-56中任一项所述的宿主，还包含编码截短的HMG-CoA的基因。58.权利要求49-57中任一项所述的宿主，还包含编码CPR的基因。59.权利要求49-58中任一项所述的宿主，所述宿主还包含编码UGT74G1多肽的基因。60.权利要求49-59中任一项所述的宿主，所述宿主还包含编码UGT85C2多肽的基因。61.权利要求49-60中任一项所述的宿主，所述宿主还包含编码UGT76G1多肽的基因。62.权利要求49-61中任一项所述的宿主，所述宿主还包含编码UGT91D2多...

【专利技术属性】
技术研发人员：GM基肖尔，M莫申，PM希克斯，J汉森，J霍顿拉森，EH汉森，MD米克尔森，S塔瓦雷斯，C布洛姆，
申请(专利权)人：伊沃瓦营养学股份有限公司，
类型：
国别省市：