高效液相色谱测定橡胶树中四种激素的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效液相色谱测定橡胶树中四种激素的方法。本发明专利技术所提供的方法包括如下步骤：（1）样品前处理：将橡胶树组织用液氮研磨后，置于抽提液中抽提，离心，从离心后的上清液中分离得到水相，将所述水相过层析柱，用甲醇洗脱，获得待测样品；（2）高效液相色谱检测：采用反相C18色谱柱，以甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲液的混合液为流动相，以254nm为检测波长，检测步骤（1）获得的待测样品中的生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素。本发明专利技术所提供的方法可一次检测出四种激素，提取流程时间短，测定准确率和精确性高，提高测定和分析效率。本发明专利技术是研究巴西橡胶树高产速生机制及植物激素在形成层分化过程中的良好方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，特别涉及一种利用高效液相色谱同时测定巴西橡胶树叶片、枝条或树皮中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的方法。
技术介绍
天然橡胶产业长期以收集胶乳作为工业原料为主，以木材、种子等其它生物量开发利用为辅。橡胶树叶片和树皮中的内源激素生长素(IAA)，赤霉素(GA3),脱落酸(ABA)和玉米素(ZT)的含量、活性以及信号路径调控胶乳产量和木材生长发育。然而，橡胶树上述四种内源激素含量极低，性质不稳定，橡胶树叶片和树皮存在多种成分干扰，造成橡胶树激素测定存在困难。传统的测定橡胶树内源激素的方法如下:用80%甲醇采取新鲜的胶乳，低温高速离心后用酶联免疫技术测定生长素(IAA),脱落酸(ABA)和细胞分裂素(iPAs)的含量(曹建华，林卫夫.巴西橡胶树胶乳中4种植物生长物质的测定.热带作物学报.2004.25:1-4)。其中提取和分离纯化的过程对激素保护不利，稍有操作不当极易造成样品中待测激素的浪费，并且不能同时进行多种植物内源激素的测定。采用透吸法收集样品，将取得的透析液在高效液相色谱仪上进样，分离并测定出其中的激素含量(姜波，李日红，金华，姜国斌，国家专利技术专利CN101738441A)。其活体取样虽具有基本不干扰生物体内正常生命活动，实现活体取样的优点，但是无法穿透老的枝条和树皮组织中，不适用巴西橡胶树这种高大乔木。ProElut PXC小柱含有混合型强阳离子交换反向吸附剂，由PLS吸附剂键合磺酸基团得到，兼具阳离子交换和反相两种保留模式，适用于其共轭酸的PKa值处于2-10之间的碱性化合物，主要为胺基化合物。主要用途是:食品安全检测三聚氰胺分析；动物样品中碱性药物残留的分析，比如磺胺类药物、盐酸克伦特罗等药物；蔬菜、水果以及果汁中碱性农药的分析，比如多菌灵、噻菌灵等杀菌剂；生物样品:血液、尿液中碱性药物的分析等等。高效液相色谱(HPLC)是测定植物激素的有效测定方法之一，并在热带水果作物荔枝、椰子中等样品中成功的测定了多种植物激素。然而，在色谱分析过程中，仅用甲醇、乙腈两种有机溶剂容易出现拖峰现象，洗脱效果不好，造成测定结果的误差。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效液相色谱测定橡胶树中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的方法。一种高效液相色谱测定橡胶树中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的方法，包括如下步骤:( I)样品前处理:将待检测的橡胶树组织用液氮研磨后，置于抽提液中抽提，离心，从离心后的上清液中分离得到水相，将所述水相过层析柱，用甲醇洗脱，获得待测样品；所述抽提液的溶质为2，6- 二叔丁基对甲苯酚，溶剂为体积百分含量为80%的甲醇水溶液；所述2，6-二叔丁基对甲苯酚在所述抽提液中的含量为每IOOmL所述抽提液中含有0.1g所述2，6-叔丁基对甲苯酚；(2)高效液相色谱检测:采用C18反相色谱柱，以甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲液的混合液为流动相，以254nm为检测波长，检测步骤(I)获得的待测样品中的生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸。在上述方法中，所述流动相中，所述甲醇、所述乙腈和所述磷酸盐缓冲液的体积比为15:15:70 ;所述流动相的pH为3.5。所述磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下:磷酸二氢钠40g/L，pH3.5。具体配制方法如下:将40g磷酸二氢钠溶于IOOOmL超纯水中，用HCl调节pH值到3.5。步骤(I)中，所述层析柱为PXC反相保留阳离子交换柱。在本专利技术的一个实施例中，所述PXC反相保留阳离子交换柱具体为北京迪马公司的产品，其产品目录号为Cat.N0.:68203A。在上述方法中，步骤(I)所述的样品前处理于黑暗条件下进行，同时保持低温(4°C)。所述黑暗为光照强度小于20 y mo I HT2s'在上述方法中，步骤(I)中，所述抽提液的用量具体可为每0.5g所述待测橡胶树组织样品(鲜重)加入15mL抽提液。在上述方法中，步骤(I)中，所述置于抽提液中抽提，抽提2次。在上述方法中，步骤(I)中，所述离心具体可为18000g离心lOmin。所述离心温度可为4°C。在上述方法中，步骤(I)中，所述从离心后的上清液中分离得到水相是通过包括如下步骤的方法实现的:向所述上清液中加入相当于所述上清液体积1/300的氨水后，过滤(0.22 y m针式过滤器过滤)后，用旋转蒸发仪真空蒸发，去除有机相，得到所述水相。用0.lmol/L盐酸调节所述水相pH为3.0，用0.22 ii m针式过滤器过滤。在上述方法中，步骤(I)中，所述“将所述水相过层析柱，用甲醇洗脱”，具体包括如下步骤:(I)活化柱子:用甲醇(如IOmL)活化所述层析柱(PXC反相保留阳离子交换柱)；(2)平衡柱子:用水(超纯水，经0.22 y m针式过滤器过滤，IOmL)平衡所述层析柱(PXC反相保留阳离子交换柱)；(3)上样:将所述水相(pH3.0，经0.22 ii m针式过滤器过滤)加到步骤(2)中平衡后的所述层析柱(PXC反相保留阳离子交换柱)；(4)淋洗:用0.lmol/L HCL (IOmL)淋洗所述层析柱(PXC反相保留阳离子交换柱)；(5)洗脱:用甲醇(IOmL)洗脱。在上述方法中，步骤(2)所述的高效液相色谱检测，柱温为30°C。在上述方法中，步骤(2)所述的高效液相色谱检测，洗脱方式为等度洗脱，流速为lmL/min,进样量为 10 u L。在本专利技术的一个实施例中，步骤(2)所述反相C18色谱柱具体为美国Waters公司生产的CNWSIL C18液相色谱柱4.6X 150mm5 u m。在上述方法中，所述橡胶树组织具体可为橡胶树的叶片、枝条或树皮。在本专利技术中，所述橡胶树具体为巴西橡胶树。所述方法既可用于定性检测橡胶树组织中的生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素，也可用于定量检测橡胶树组织中的生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的含量。在本专利技术中，进行定量检测时，HPLC检测已知系列浓度的激素标准品溶液，以峰面积(Y)对标准品浓度(x，mg/L)进行回归计算，得该激素的标准曲线方程，再根据待测样品中该激素的实测峰面积，计算该激素在待测样品中的含量。本专利技术所提供的高效液相色谱测定橡胶树中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的方法，可一次检测出四种激素，提取流程时间短，测定准确率和精确性高，提高测定和分析效率。本专利技术是研究巴西橡胶树高产速生机制及植物激素在形成层分化过程中的良好方法。附图说明图1为四种激素混合标准品的高效液相色谱图。其中，峰I为玉米素(ZT)，峰2为赤霉素(GA3),峰3为生长素(IAA),峰4为脱落酸(ABA)。图2为橡胶树叶片中的四种激素检测的高效液相色谱图。其中，峰I为玉米素(ZT),峰2为赤霉素(GA3)，峰3为生长素(IAA),峰4为脱落酸(ABA)。图3为橡胶树枝条中的四种激素检测的高效液相色谱图。其中，峰I为玉米素(ZT),峰2为赤霉素(GA3)，峰3为生长素(IAA),峰4为脱落酸(ABA)。图4为橡胶树树皮中的四种激素检测的高效液相色谱图。其中，峰I为玉米素(ZT)，峰2为生长素(IAA)，峰3为脱落酸(ABA)。图5为橡胶树叶片中的四种激素检测的高效液相色谱图(样品前处理方法I)。图6为橡胶树叶片中的四种激素检测的高效液相色谱图(样品前处本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效液相色谱测定橡胶树中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的方法，包括如下步骤：（1）样品前处理：将待检测的橡胶树组织研磨后，置于抽提液中抽提，离心，从离心后的上清液中分离得到水相，将所述水相过层析柱，用甲醇洗脱，获得待测样品；所述抽提液的溶质为2,6?二叔丁基对甲苯酚，溶剂为体积百分含量为80%的甲醇水溶液；所述2,6?二叔丁基对甲苯酚在所述抽提液中的含量为每100mL所述抽提液中含有0.1g所述2,6?二叔丁基对甲苯酚；（2）高效液相色谱检测：采用C18反相色谱柱，以甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲液的混合液为流动相，以254nm为检测波长，检测步骤（1）获得的待测样品中的生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸。

【技术特征摘要】
1.一种高效液相色谱测定橡胶树中生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸四种激素的方法，包括如下步骤: (1)样品前处理:将待检测的橡胶树组织研磨后，置于抽提液中抽提，离心，从离心后的上清液中分离得到水相，将所述水相过层析柱，用甲醇洗脱，获得待测样品； 所述抽提液的溶质为2，6- 二叔丁基对甲苯酚，溶剂为体积百分含量为80%的甲醇水溶液；所述2，6-二叔丁基对甲苯酚在所述抽提液中的含量为每IOOmL所述抽提液中含有0.1g所述2，6- 二叔丁基对甲苯酚； (2)高效液相色谱检测:采用C18反相色谱柱，以甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲液的混合液为流动相，以254nm为检测波长，检测步骤(I)获得的待测样品中的生长素、玉米素、赤霉素和脱落酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述流动相中，所述甲醇、所述乙腈和所述磷酸盐缓冲液的体积比为15:15:70 ;所述流动相的pH为3.5。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述层析柱为PXC反相保留阳...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立丰，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院橡胶研究所，
类型：发明
国别省市：