本发明专利技术涉及一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒及其制备方法。液相芯片主要包括有：分别包被了氧化性低密度脂蛋白（oxidizedlowdensitylipoprotein,ox-LDL）、可溶性CD40配体（solubleCD40ligand,sCD40L）、基质金属蛋白酶9（matrixmetallopeptidase9,MMP-9）、组织因子（tissuefactor,TF）、网膜素（omentin）和内源性可溶性RAGE（endogenoussecretoryreceptorofadvancedglycationendproducts,esRAGE）捕获抗体的微球；生物素标记的检测抗体以及链亲和素藻红蛋白。本发明专利技术所提供的液相芯片具有检测效率高、所需样本量少、特异性强、灵敏度高、检测快速准确等优点。同时，该芯片同时反映了机体内保护性和损伤性因素水平的高低，以便更全面综合评估患者的危险分层和预后情况。同时本发明专利技术的制备方法简单易行，稳定性好，其技术方案中的各种工艺参数如微球和抗体的量、反应过程等均是在大量实验基础上得出的，为制备过程最佳的参数值。
【技术实现步骤摘要】
:本专利技术涉及的体外试剂盒
，具体地说是。
技术介绍
:动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)性血管疾病已成为威胁国人健康的头号杀手，随着我国经济的发展，发病率呈逐年上升趋势，我国每年用于该类疾病的医疗费用高达千亿元人民币，加强AS性血管疾病及其并发症的防治已成为我国重大疾病防治的主要任务。AS性血管疾病引发的急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome,ACS)是临床最常见和最严重的表现，而冠脉易损斑块破裂继发血栓形成是其发生的最主要病理基础。目前作为冠心病诊断“金标准”的冠状动脉造影并不能很好的识别易损斑块，易损斑块的识别和诊断主要依赖于血管内超声及血管镜等介入影像学手段，可以显示血管壁的病变，精确地区别病变的性质来识别易损斑块，但却不能检测斑块中的炎症活性，更由于其为有创性检查，技术条件要求高且费用较昂贵，限制了它的推广应用。因此，寻找能反映AS易损斑块敏感而特异性的血清学标志物，并通过有效干预，在易损斑块破裂前，早期将其识别并使之趋向稳定，有望达到减少ACS发生的目的。但现有的诊断试剂盒多集中于借助外周血清标志物提高对ACS的诊断敏感性和特异性方面，在改善患者的危险分层和预后判断方面的相关试剂盒还是一个空白，而这方面恰恰是目前临床患者管理所急需的。液相芯片技术(xMAP)也称为流式荧光技术，是一种可广泛应用于蛋白、基因、受体/配体等多种生物反应的生物芯片技术平台，主要包括微球、探针分子、被检测物和报告分子四种成分，其微球在制作过程中使用不同配比的两种红色分类荧光染料将微球(微球分为直径为5.6 μ m的聚苯乙烯微球和6.5 μ m的磁性微球,两种微球主要在后期的洗漆和适用的仪器有所不同，原理一致)染成不同的荧光色，从而获得多达100种荧光编码的微球。把针对不同待测物的抗体分子或者基因探针以共价交联的方式结合到特定的编码微球上，每个编码微球都对应相应的检测项目。先把针对不同待测物的荧光编码微球混合，然后加入待测物质或者待测的扩增片段，所形成的复合物再与标记荧光素发生结合反应。微球在流动鞘液的带动下单列依次通过红绿激光，红激光用来判定微球的荧光编码，绿激光用来测定微球上报告分子的荧光强度。从而达到快速准确的定量检测目的。由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构想，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高
技术实现思路
:本专利技术的目的在于提供一种改进的用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒以其制备方法，它可克服现有技术中诊断试剂盒多集中于借助外周血清标志物提高对ACS的诊断敏感性和特异性方面，在改善患者的危险分层和预后判断方面的相关试剂盒还是一个空白，同时现有试剂盒的制备方法复杂、稳定性差、应用效果不佳的一些不足。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是:一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒，其特征在于:所述的液相芯片试剂盒包括有以下组分:I)包被微球:微球主要包括两类,一种直径为5.6μηι的聚苯乙烯微球和另一种6.5 μ m的磁性微球，上述两类微球分别包被了 ox-LDL捕获抗体的微球、包被了 s⑶40L捕获抗体的微球、包被了 MMP-9捕获抗体的微球、包被了 TF捕获抗体的微球、包被了 omentin捕获抗体的微球和包被了 esRAGE捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；2)生物素标记检测抗体:含有分别用生物素标记的ox-LDL、s⑶40L、MMP_9、TF、omentin及esRAGE的检测抗体；3)链亲合素藻红蛋白。一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒的制备方法，其特征在于:所述的制备方法包括有如下步骤:I)按照上述试剂盒的组成，制备相应的抗体包被微球:分别选取不同的微球，经涡旋或超声悬浮20-25秒；将50 μ I微球活化后，离心条件为彡8000g,离心1-2分钟；吸去上清，将微球重悬于250 μ I 50mM的MES的溶液中，涡旋25_30秒，超声25-30秒，离心收集活化后的微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟；重复该步骤一次；吸去上清，将微球重悬于100 μ I 50mM的MES的溶液中，涡旋25_30秒，超声25-30秒，加入I μ g的抗体，用50mM的MES的溶液将总体积补至500 μ I ;经涡旋震荡混匀，室温避光振荡3小时；离心收集偶联抗体的微球，离心条件为> 8000g，离心2-3分钟；吸去上清，将微球重悬于500 μ 1的PBS-TBN溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，室温避光震荡30分钟，离心收集微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟；吸去上清，将微球重悬于Iml的PBS-TBN溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，离心收集微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟重复该步骤一次；吸去上清，将微球重悬于600 μ I的PBS-TBN溶液中，将包被好的微球送往Luminex仪器或流式细胞仪计数；包被好抗体的微球置于2-8度避光保存，每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，根据检测项目选择等比例混合。2)进行每种检测抗体的生物素标记:依据蛋白浓度计算反应体系:计算将抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，为目标体积(V)，配制NHS-Biotin反应液(用DMSO溶解，终浓度为10mg/ml);按摩尔比I: 100的比例在反应管中分别加入检测抗体和N-Biotin反应液；加入1/10V的碳酸氢钠溶液(pH8.9)；加入PBS溶液补至目标体积；包上铝箔或放入避光暗盒中，将反应管或避光暗盒置于圆周震荡器上，于25度恒温箱中避光孵育5小时，转速为IOOOrpm ；将反应管中的液体转至透析卡中，于1000倍体积的PBS缓冲液中透析过夜两次，以去除未反应的NHS-Biotin，测定蛋白浓度。使用时，本专利技术的所公开的液相芯片试剂盒可以同时完成多种血清标志物的定量检测，从而达到对急性冠脉综合患者的危险分层和预后判断，还具有检测效率高，所需样本量少，特异性强，灵敏度高等优点，同时检测的血清标志物以ox-LDL、TF、s⑶40L为核心，通过与剩余的esRAGE、MMP-9和omentin进行不同搭配,可实现从损伤和修复两个角度全面综合评估患者的预后情况。同时本专利技术的制备方法简单易行，稳定性好，其技术方案中的各种工艺参数如微球和抗体的量、反应过程等均是在大量实验基础上得出的，为制备过程最佳的参数值。附图说明 图1为本专利技术正常对照人群和ACS患者外周血ox-LDL水平(μ g/ml)的对照表。 图2为本专利技术正常对照人群和ACS患者外周血s⑶40L水平(ng/ml)的对照表。 图3为本专利技术正常对照人群和ACS患者外周血TF水平(ng/ml)的对照表。 图4为本专利技术正常对照人群和ACS患者外周血MMP-9水平(ng/ml)的对照表。 图5为本专利技术正常对照人群和ACS患者外周血omentin水平(ng/ml)的对照表。 图6为本专利技术正常对照人群和ACS患者外周血esRAGE水平(ng/ml)的对照表。 图7为本专利技术依据血清标志物进行ACS患者的危险分层的图表。具体实施方式:下面结合图表和实施例对本专利技术作进一步的描述。本专利技术的一种用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒，其特征在于：所述的液相芯片试剂盒包括有以下组分：1）包被微球：微球主要包括两类，一种直径为5.6μm的聚苯乙烯微球和另一种6.5μm的磁性微球，上述两类微球分别包被了ox?LDL捕获抗体的微球、包被了sCD40L捕获抗体的微球、包被了MMP?9捕获抗体的微球、包被了TF捕获抗体的微球、包被了omentin捕获抗体的微球和包被了esRAGE捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；2）生物素标记检测抗体：含有分别用生物素标记的ox?LDL、sCD40L、MMP?9、TF、omentin及esRAGE的检测抗体；3）链亲合素藻红蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒，其特征在于:所述的液相芯片试剂盒包括有以下组分: 1)包被微球:微球主要包括两类，一种直径为5.6 μ m的聚苯乙烯微球和另一种6.5 μ m的磁性微球，上述两类微球分别包被了 ox-LDL捕获抗体的微球、包被了 SCD40L捕获抗体的微球、包被了 MMP-9捕获抗体的微球、包被了 TF捕获抗体的微球、包被了 omentin捕获抗体的微球和包被了 esRAGE捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码； 2 )生物素标记检测抗体:含有分别用生物素标记的ox-LDL、s⑶40L、MMP-9、TF、omentin及esRAGE的检测抗体；3)链亲合素藻红蛋白。2.根据权利要求1所述的一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒，其特征在于:每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为120-130个/μ I ;每种生物素标记检测抗体的使用浓度为1-4 μ g/mL.3.根据权利要求1所述的一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒的制备方法，其特征在于:所述的制备方法包括有如下步骤: O按照上述试剂盒的组成，制备相应的抗体包被微球: 分别选取不同的微球，经涡旋或超声悬浮20-25秒；将50 μ I微球活化后，离心条件为^ 8000g， 离心1-2分钟； 吸去上清，将微球重悬于250 μ I 50mM的MES的溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，离心收集活化后的微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟；重复该步骤一次； 吸去上清，将微球重悬于100 μ I 50mM的MES的溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，加入I μ g的抗体,用50mM的MES的溶液将总体积补至500 μ I ; 经涡旋震荡混匀，室温避光振荡3小时；离心收集偶联抗体的微球，离心条件为^ 8000g，离心2-3分钟； 吸去上清，将微球重悬于500 μ I的PBS-TBN溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，室温避光震荡30分钟，离心收集微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟； 吸去上清，将微球重悬于Iml的PBS-TBN溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，离心收集微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟重复该步骤一次； 吸去上清，将微球重悬于600 μ I的PBS-TBN溶液中，将包被好的微球送往Luminex仪器或流式细胞仪计数；包被好抗体的微球置于2-8度避光保存，每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，根据检测项目选择等比例混合； 2)进行每种检测抗体的生物素标记:依据蛋白浓度计算反应体系:计算将抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，为目标体...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴宗贵，梁春，贺治青，张家友，潘晓明，樊民，李玫，丁茹，甄奕，伍锋，朱琳，王新，刘焕波，
申请(专利权)人：吴宗贵，梁春，贺治青，
类型：发明
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