本发明专利技术公开了一种桑黄菌（火木层孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz）中环二肽C6的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，采用氯仿与甲醇洗脱，然后是甲醇凝胶层析，经HPLC检测后，进行高压反相制备，经HPLC检测，适当合并洗脱液，减压干燥，即得环二肽C6，即六氢-7-羟基-3-（2-甲基丙基）吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4-二酮。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程制药领域。
技术介绍
Phellinus，子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，2-12*3-21厘米，厚1.5-10厘米，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱.边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层.菌肉深咖啡色，硬，木质.菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝.管口锈褐色至酱色，圆形，每毫米4-5个.孢子近球形，光滑，无色，5-6*3-4微米.刚毛顶端尖锐，基部膨大，10-25*5-7微米.菌丝不分枝，无横隔，直径3-5微米。目前，真菌产物的纯化方法较多，主要有分级沉淀法、制备性高效液相层析、柱层析法、超滤法、离心沉淀色谱法、等几种方法。而其中应用最多的当属柱层析法，分为两类:一是只有分子筛作用的凝胶柱层析，常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶。二是离子交换层析。但，主要用于分离多糖，透明质酸等，多数分离后得到的产物为混合物。本专利技术使用多种层析技术相结合，分离度高，应用此专利技术可以精致到纯品。
技术实现思路
本专利技术公开了一种桑黄菌(火木层孔菌igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木层孔菌phel linus linteus (Berk et Curt) Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中环二妝 C6 的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，采用氯仿与甲醇洗脱，，然后是甲醇凝胶层析，经HPLC检测后，进行高压反相制备，经HPLC检测，适当合并洗脱液，减压干燥，即得环二肽C6，即六氢-7 -羟基-3 - (2 -甲基丙基)吡咯并[l，2-a〕吡嗪_1，4 - 二酮。此化合物目前已报道具有广谱抗菌作用。本专利技术的技术方案如下: 桑黄粗提物，由下述方法制得: (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸镁 0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05%(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20 35°C温度，摇瓶转速为80 280r/min，pH 3 8条件下，震动培养7 15天；培养中当pH值降到2.5 4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20 35°C，发酵罐压力0.1 0.2公斤/平方厘米，pH 3 8，通气量0.5 1.1vvm,搅拌速度100 280转/分的条件，培养7 15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物； (3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2 1/5 ； (4)用体积百分比为60 95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2 5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60 90% ； (5)对步骤(4)所得提取液在50 70°C条件下，加热I 2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 1/10 ； (6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。分离环二肽C6的方法: 桑黄菌粗提物一正相硅胶层析一甲醇梯度洗脱一HPLC检测一高压反相制备一HPLC检测一ID-HNMR —环二肽 C6。具体方法为: (1)制备桑黄菌粗提物； (2)将上述步骤(I)所得的桑黄菌粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次； (3)收集上述步骤(2)中最后一次洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱； (4)使用HPLC检测收集的步骤(3)得到的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥； (5)将步骤(4)得到的产物进行高压反相层析，洗脱剂为甲醇与水； (6)对步骤(5)得到的产物进行HPLC检测，减压干燥，即为环二肽C6。本专利技术由桑黄菌中环二肽C6的分离技术的显著优势:本方法采用多种层析技术相结合，可以精致到结构明确，纯度大于95%的环二肽C6。技术路线成熟明确，高效精确。附图说明图1为环二肽C6的结构式； 图2为环二肽C6的一维核磁共振H谱。具体实施例方式实例1:` 桑黄粗提物，由下述方法制得: (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是: 玉米淀粉 1%葡萄糖 1% 蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1% 硫酸镁 0.1%磷酸二氢钾0.01% (2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25°C温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当pH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25°C，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通气量0.5-1.lvvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物； (3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3 ； (4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55% ； (5)对步骤(4)所得提取液在70°C条件下，加热I小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ； (6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。称取粗提物300g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200目正相硅胶，柱高lm，直径20cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿:甲醇=75:1分别洗脱4，5个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-l，Fr-2。将Fr_2用甲醇溶解，进行甲醇凝胶层析，洗脱剂为甲醇。然后是HPCL检测，条件为Omin:0%甲醇，IOmin:100%甲醇，出峰时间为4.95min。然后，进行高压反相制备，A相为水，B相为甲醇。洗脱浓度为25%_75%的甲醇水溶液。收集洗脱液，减压蒸干，HPLC检测，适当合并，进行ID-HNMR核磁共振分析，频率为 400MHZ，分析结果为 δ 7.51 (s, 1H), 4.03 (dd, J = 34.9，28.1 Hz, 2H), 3.81-3.33 (m, 2H), 2.36 (d, J = 8.8 Hz, 2H)，2.15 - 1.68 (m, 5H)，1.60 (dd, J =10.1, 3.8 Hz, 2H), 0.94 (ddd, J = 18.8，17.2, 9.8 Hz, 7H).证明是环二肽C6，即六氢-7 -羟基-3 - (2 -甲基丙基)卩比咯并[l，2-a〕吡嗪_1，4 - 二酮。实例2: 桑黄粗提物，由下述方法制得: (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是: 玉米淀粉 3%葡萄糖 2% 蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5% 硫酸镁 0.5%磷酸二氢钾0.05% (2)将桑黄菌种以常本文档来自技高网...
【技术保护点】
桑黄菌中环二肽C6的高压反相制备分离方法，其步骤顺序如下：(1)制备桑黄菌粗提物；(2)将上述步骤（1）所得的桑黄菌粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2?5次；(3)收集上述步骤（2）中最后一次洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱；(4)使用HPLC检测收集的步骤（3）得到的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；(5)将步骤（4）得到的产物进行高压反相层析，洗脱剂为甲醇与水；(6)对步骤（5）得到的产物进行HPLC检测，减压干燥，即为环二肽C6。
【技术特征摘要】
1.桑黄菌中环二肽C6的高压反相制备分离方法，其步骤顺序如下: (1)制备桑黄菌粗提物； (2)将上述步骤(I)所得的桑黄菌粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次； (3)收集上述步骤(2)中最后一次洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱； (4)使用HPLC检测收集的步骤(3)得到的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥； (5)将步骤(4)得到的产物进行高压反相层析，洗脱剂为甲醇与水； (6)对步骤(5)得到的产物进行HPLC检测，减压干燥，即为环二肽C6。2.如权利要求1所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黄粗提物，由下述方法制得: (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸镁 0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05% (2)如权利要求1所述桑黄粗提物的发酵培养方法是，将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20 35 °C温度，摇瓶转速为80 280r/min，pH 3 8条件下，震动培养7 15天；培养中当pH值降到2.5 4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20 35°C，发酵罐压力0.1 0.2公斤/平方厘米，pH 3 8，通气量0.5 1.1vvm,搅拌速度100 280转/分的条件，培养7 15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物； (3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2 1/5 ； (4)用体积百分比为60 95...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵晨，宋爱荣，孙效乐，杨松，张伟鑫，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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