本发明专利技术公开了一种桑黄菌（火木层孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz）中新的桉烷型倍半萜的分离技术。首先制备桑黄菌粗提物，然后是正相硅胶层析，使用氯仿与甲醇梯度洗脱，重复一次正相硅胶层析，接着进行氯仿甲醇凝胶层析，再次进行正相硅胶层析，最后减压蒸干得到新的桉烷型倍半萜。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程制药领域。
技术介绍
桑黄，子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，2-12*3-21厘米，厚I. 5-10厘米，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱.边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层.菌肉深咖啡色，硬，木质.菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝.管口锈褐色至酱色，圆形，每毫米4-5个.孢子近球形，光滑，无色，5-6*3-4微米.刚毛顶端尖锐，基部膨大，10-25*5-7微米.菌丝不分枝，无横隔，直径3-5微米。 目前，真菌产物的纯化方法较多，主要有分级沉淀法、制备性高效液相层析、柱层析法、超滤法、离心沉淀色谱法、等几种方法。而其中应用最多的当属柱层析法，分为两类一是只有分子筛作用的凝胶柱层析，常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶。二是离子交换层析。但，主要用于分离多糖，透明质酸等，多数分离后得到的产物为混合物。本专利技术使用多种层析技术相结合，分离度高，应用此专利技术可以精致到纯品。
技术实现思路
本专利技术公开了一种桑黄菌(火木层孔菌igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木层孔菌phellinus linteus (Berk et Curt) Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中 1，2_ 新的按烧型倍半職的分离技术。首先制备桑黄粗提物，然后是正相硅胶层析，使用氯仿与甲醇梯度洗脱，重复一次正相硅胶层析，接着进行氯仿甲醇凝胶层析，再次进行正相硅胶层析，最后减压蒸干得到1，2-新的桉烷型倍半萜。 本专利技术的技术方案如下 桑黄粗提物，由下述方法制得 (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸镁 O. 1-0. 5%磷酸二氢钾O. 01-0. 05% (2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20 35°C温度，摇瓶转速为80 280r/min，pH 3 8条件下，震动培养7 15天；培养中当pH值降到2.5 4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20 35°C，发酵罐压力O.I O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通气量O. 5 I. Ivvm,搅拌速度100 280转/分的条件，培养7 15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物； (3)取步骤(2)中所得 桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2 1/5 ；(4)用体积百分比为60 95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2 5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60 90% ； (5)对步骤(4)所得提取液在50 70°C条件下，加热I 2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 1/10 ； (6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。 分离桉烷型倍半萜的方法 桑黄菌粗提物一正相硅胶层析一氯仿与甲醇梯度洗脱一TLC检测一正相硅胶层析一氯仿甲醇凝胶层析一TLC检测一正相硅胶层析一TLC检测一减压蒸干一无色油状物(新的桉烷型倍半萜)。 具体方法为 (1)制备桑黄菌粗提物； (2)将步骤(I)所得的沉淀物与正相硅胶混匀搅拌，干燥后进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱2-5次，得到洗脱液； (3)将步骤(2)中最后一次洗脱液蒸干，等体积硅胶拌样，进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱； (4)收集步骤(3)中的洗脱液，减压浓缩，使用氯仿甲醇=1:1溶解，进行甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥； (5)将步骤(4)中得到的产物进行再次进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱； (6)收集步骤(5)得到的洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，适度合并洗脱液，减压干燥，即为1,2-桉烧型倍半職。 附图说明 图I为本专利技术的桉烷型倍半萜的结构式； 图2为桉烷型倍半萜的一维核磁共振H谱。 具体实施例方式 实例I : 桑黄粗提物，由下述方法制得 (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是 玉米淀粉 1%葡萄糖 1% 蛋白胨 O. 1%酵母膏 O. 1% 硫酸镁 O. 1%磷酸二氢钾0.01% (2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25°C温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当pH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25°C，发酵罐压力O. I公斤/平方厘米，pH 3，通气量O.5-1. lvvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物； (3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3 ； (4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55% ； (5)对步骤(4)所得提取液在70°C条件下，加热I小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ； (6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。 将上述得物称取300g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高lm，直径15cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿甲醇=100:1-200:1，分别洗脱2，3个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-1，Fr_2。将Fr_2等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200— 300目正相硅胶。洗脱剂为石油醚与丙酮。减压浓缩洗脱液，使用甲醇氯仿=1:1溶解，氯仿甲醇凝胶柱层析。使用TLC检测收集的洗脱液适当合并，减压蒸干，再次使用正相硅胶层析，洗脱剂为氯仿甲醇=100:1-50:1，收集洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，合并收集出现斑点的洗脱液，展开剂为石油醚丙酮=30 :1-35: I。减压干燥，进行ID-13CNMR核磁共振分析，频率为 101 ΜΗζ，δ 80.14，75.46，69.61，54.26，51.95，39.88，39.43，30.86，30.46，30.37，30. 22, 29.65，25.78，23.77，22.61，14.89，14. 51.分析结果为证明是为新的桉烷型倍半萜。 实例2 桑黄粗提物，由下述方法制得 (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是 玉米淀粉 3%葡萄糖 2% 蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%` 硫酸镁 0.5%磷酸二氢钾0.05% (2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以30°C温度，摇瓶转速为180r/min，pH6条件下，震动培养15本文档来自技高网...
【技术保护点】
桑黄菌中新的桉烷型倍半萜的分离方法，其步骤顺序如下：(1)?制备桑黄粗提物；(2)将步骤（1）所得的沉淀物与正相硅胶混匀搅拌，干燥后进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱2?5次，得到洗脱液；(3)将步骤（2）中最后一次洗脱液蒸干，等体积硅胶拌样，进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱；(4)收集步骤（3）中的洗脱液，减压浓缩，使用氯仿：甲醇=1:1溶解，进行甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；(5)将步骤（4）中得到的产物进行再次进行正相硅胶层析,使用洗脱剂洗脱；(6)收集步骤（5）得到的洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，适度合并洗脱液，减压干燥，即为1,2?桉烷型倍半萜。
【技术特征摘要】
1.桑黄菌中新的桉烷型倍半萜的分离方法，其步骤顺序如下 (1)制备桑黄粗提物； (2)将步骤(I)所得的沉淀物与正相硅胶混匀搅拌，干燥后进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱2-5次，得到洗脱液； (3)将步骤(2)中最后一次洗脱液蒸干，等体积硅胶拌样，进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱； (4)收集步骤(3)中的洗脱液，减压浓缩，使用氯仿甲醇=1:1溶解，进行甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥； (5)将步骤(4)中得到的产物进行再次进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱； (6)收集步骤(5)得到的洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，适度合并洗脱液，减压干燥，即为1,2-桉烧型倍半職。2.如权利要求I所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黄粗提物，由下述方法制得 (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸镁 O. 1-0. 5%磷酸二氢钾O. 01-0. 05% (2)如权利要求I所述桑黄粗提物的发酵培养方法是，将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20 35 °C温度，摇瓶转速为80 280r/min，pH 3 8条件下，震动培养7 15天；培养中当pH值降到2. 5 4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20 35°C，发酵罐压力O. I O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通气量O. 5 I. Ivvm,搅拌速度100 280转/分的条件，培养7 15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物； (3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋爱荣，赵晨，孙效乐，黄芳，王光远，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。