本发明专利技术涉及检测肉制品中恩拉霉素残留的方法，属于食品检测技术领域。本发明专利技术所解决的技术问题是提供了一种检测限更低的检测肉制品中恩拉霉素残留的方法。本发明专利技术检测肉制品中恩拉霉素残留的方法包括如下步骤：a、分别将待检测肉制品提取液和系列浓度的恩拉霉素标准液加入到预包被恩拉霉素抗原的微孔中；b、然后于各微孔中加入抗恩拉霉素抗体，混匀后孵育；c、于各微孔中加入辣根过氧化物酶HRP—羊抗兔IgG，混合后孵育；d、分别于各微孔中加入底物溶液，显色；e、分别于各微孔中加入终止液终止反应，用酶标仪读取各孔OD450值；f、对照恩拉霉素标准液所得的曲线回归方程，计算出待检测肉制品中的恩拉霉素含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于食品检测
技术介绍
恩拉霉素(Enramycin)，又名恩来霉素、恩霉素、安来霉素、持久霉素，是由土壤中分离出来的放线菌Streptomyces fungicidious N0.B5477发酵产生的一种多肽类抗生素。该药于1966年由日本武田药品工业株式会社研发，1974年在日本正式注册，其后在许多国家被注册和广泛使用。该药对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌、破伤风梭菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌等革兰氏阳性菌有很强的杀菌活性，可通过抑制肠道中有害细菌的生长和繁殖来改变肠道内的菌群平衡，增加饲料中营养物质的吸收和利用。长期使用该药，不易产生耐药性，与其他抗生素之间不产生明显交叉耐药，同时有化学性能稳定，无致突、致畸、致癌作用，不易被吸收，残留少，适口性好等优势，因此被世界上许多国家推荐作为抗生素促生长剂，常作为饲料添加剂用于促进动物增重和提高饲料利用效率。1988年我国农业部批准进口该药，现在已有恩拉霉素预混料销售，并且呈现良好的市场发展前景。随着全球贸易自由化进程的加快，以及“二噁英”、药物残留等有毒有害物质造成的重大动物源性食品污染事件的频发，世界各国都构筑起各具特色的动物产品质量安全管理体系，从法律法规体系、检验检疫监管体系、标准体系、认证体系等方面来保证动物源性产品的质量安全。由于对动物产品药残检测研究起步较晚，我国的药残检测标准和检测水平落后于发达国家。发达国家凭借在科技、管理、环保等方面的优势，从技术法规、标准、合格评定程序等方面对我国动物产品出口不断设置新的“绿色贸易壁垒”门槛，致使在我国国内合格的动物产品在出口后被进口国检出抗生素、农药、兽药残超标而被退回或销毁的事件屡见不鲜，造成的直接和间接经济损失在百亿美元以上。因此，提高我国动物产品药残的检测水平势在必行。兽药残留检测是复杂混合物中痕量组分的分析技术，抗生素的残留量一般都在微克到纳克级，经典的化学分析法无法检测或定量不够准确，因此要求残留抗生素检测法必须达到灵敏、快速、高效。抗生素残留检测法总体可以归为3大类:微生物检测法、理化检测法和免疫分析技术。微生物检测法是应用较广泛的方法，其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，来定性或定量确定样品中抗生素微生物药物残留，其衍生出的纸片法(PD)对氯霉素最低检出量0.01mg/L ;氯化三苯基四氮唑法(tripheye tetrazoliumchloride, TTC法)对青霉素的最低检出量为0.004IU/mL ;管碟法对青霉素的敏感度为0.01U/mL ;戴尔沃检测法(SP)其灵敏度为:青霉素3ng/mL，链霉素300ng/mL，庆大霉素400ng/mL。随着研究的深入，还出现了拭子法、牛的抗生素和磺胺实验法(CAST)、快速抗生素筛选法(FAST)等更为灵敏、准确、简便、快速的微生物检测方法。微生物检测方法能检测出接近最高残留限量浓度水平的样品，能够进行大批量、快速、灵敏的测定，且可以非实验室环境下进行。微生物检测法具有不需要特殊设备、操作简单、易推广、灵敏度高、适用于大批量样品的同时检测等优点，缺点是操作繁琐，检测周期长，环境要求高，显色状态判断通过肉眼判断，其结果的主观性强。理化检测法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、质谱法、联用技术等，能进行定性、定量和药物鉴定，敏感性较高，但有的检测程序较复杂，检测成本高，仪器设备要求高，操作规范严格。免疫分析技术是目前最理想的残留筛选性分析方法之一。在目前药物残留分析中主要分为两大类:一为相对独立的分析方法，即免疫测定法(Immunoassays, IAs),如RIA、ELESA、固相免疫传感器等；二是将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，如免疫亲合色谱(IAC)，它可使兽药残留分析将免疫技术的高选择性和理化技术的快速分离和灵敏性融为一体，避免了 IA直接测定样本信息量太少、假阳性或理化分析技术选择性低等不足，分析过程简化。IAC-HPLC或IAC-GC是常见的联用方式，如氯霉素、阿维菌素和伊维菌素等残留分析。未来兽药残留分析技术中的免疫分析技术将向试剂标准化、使用更灵敏和抗干扰性强的标记物和理化分析技术联用方向发展。 免疫分析技术与常规的理化分析技术相比，最突出的优点是操作简单，速度快、分析成本低。如ELISA法，免疫测定方法取样量小，前处理简单，容量大，仪器化程度低，检测与GC/MS或GC/ECD相似，可达到ng/g-pg/g级，分析效率则为HPLC或GC的几十倍以上。目前大部分抗生素已经建立了免疫测定法，如磺胺二甲嘧啶、氯霉素、沙拉沙星、链霉素、四环素、莫能菌素等。ELISA试剂盒是目前使用最广泛、快速、灵敏的检测抗生素残留的方法，但是各类抗生素试剂盒多为国外生产，使得国内检测花费非常大，如德国拜耳公司生产的抗生素检测试剂盒，一个96次检测试剂盒要花3800元，每个样品的检测要花3(Γ50元，因此很有必要研制和开发出国产的试剂盒，以降低成本，提高经济效益。日本已建立畜、水产性食品中恩拉霉素残留检测方法，我国建立了恩拉霉素预混料和饲料级的检测，袁而森(1999)在此基础上探索过对肉制品残留检测，检测限量为0.3ppm，其检测方法都是微生物检测法。Horie (1985)利用高效液相色谱分析猪、鸡肌肉恩拉霉素残留，检测限量为0.2ppm。恩拉霉素的ELISA检测方法和试剂盒都未曾见报道。由于目前世界各国的食品安全卫生控制指标限量逐步降低，食源性危害关键检测技术趋向高科技化、系列化(多残留检测)、速测化、器具便携化，建立新的高敏感度、便携化的、低成本的恩拉霉素药残检测方法以适应现在的动物产品检验检疫要求是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测限更低的。本专利技术包括如下步骤:a、分别将待检测肉制品提取液和系列浓度的恩拉霉素标准液加入到预包被恩拉霉素抗原的微孔中；其中，所述的肉制品提取液采用下述方法制备得到:取待检测肉制品剪碎，匀衆，加浓度为50%v/v的甲醇-水溶液，匀浆，用浓HCl调整pH值3.5 4.0,混匀，8000 12000rpm离心8 12min，取上清液，用NaOH调节pH值至8.0,8000 12000离心8 12min，取上清液，即得待检测肉制品提取液；所述的恩拉霉素抗原采用申请号为CN201010556432.2的方法制备得到；b、然后于各微孔中加入抗恩拉霉素抗体，混匀后孵育；C、于各微孔中加入辣根过氧化物酶HRP—羊抗兔IgG，混合后孵育；d、分别于各微孔中加入底物溶液，显色；e、分别于各微孔中加入终止液终止反应，用酶标仪读取各孔0D450值；f、对照恩拉霉素标准液所得的曲线回归方程，计算出待检测肉制品中的恩拉霉素含量。其中，采用a步骤中的方法制备肉制品提取液可以提高待检测肉制品中的恩拉霉素的溶解性和回收率，同时还提高了提取液中的恩拉霉素的稳定性。其中，本专利技术，所述的恩拉霉素抗原可以采用申请号为CN201010556432.2，专利技术名称为“一种恩拉霉素完全抗原的合成方法”的专利申请公开的方法制备得到。 其中，为了节本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测肉制品中恩拉霉素残留的方法，其特征在于包括如下步骤：a、分别将待检测肉制品提取液和系列浓度的恩拉霉素标准液加入到预包被恩拉霉素抗原的微孔中；其中，所述的肉制品提取液采用下述方法制备得到：取待检测肉制品剪碎，匀浆，加浓度为50%v/v的甲醇?水溶液，匀浆，用浓HCl调整pH值3.5～4.0，混匀，8000～12000rpm离心8～12min，取上清液，用NaOH调节pH值至8.0，8000～12000离心8～12min，取上清液，即得待检测肉制品提取液；所述的恩拉霉素抗原采用申请号为CN201010556432.2的方法制备得到；b、然后于各微孔中加入抗恩拉霉素抗体，混匀后孵育；c、于各微孔中加入辣根过氧化物酶HRP—羊抗兔IgG，混合后孵育；d、分别于各微孔中加入底物溶液，显色；e、分别于各微孔中加入终止液终止反应，用酶标仪读取各孔OD450值；f、对照恩拉霉素标准液所得的曲线回归方程，计算出待检测肉制品中的恩拉霉素含量。
【技术特征摘要】
1.测肉制品中恩拉霉素残留的方法，其特征在于包括如下步骤: a、分别将待检测肉制品提取液和系列浓度的恩拉霉素标准液加入到预包被恩拉霉素抗原的微孔中；其中，所述的肉制品提取液采用下述方法制备得到:取待检测肉制品剪碎，匀浆，加浓度为50%v/v的甲醇-水溶液，匀浆，用浓HCl调整pH值3.5 4.0，混匀，8000 12000rpm离心8 12min，取上清液，用NaOH调节pH值至8.0,8000 12000离心8 12min，取上清液，即得待检测肉制品提取液；所述的恩拉霉素抗原采用申请号为CN201010556432.2的方法制备得到； b、然后于各微孔中加入抗恩拉霉素抗体，混匀后孵育； C、于各微孔中加入辣根过氧化物酶HRP—羊抗兔IgG，混合后孵育； d、分别于各微孔中加入底物溶液，显色； e、分别于各微孔中加入终止液终止反应，用酶标仪读取各孔OD45tl值； f、对照恩拉霉素标准液所得的曲线回归方程，计算出待检测肉制品中的恩拉霉素含量。2.根据权利要求1所述的检测肉制品中恩拉霉素残留的方法，其特征在于:b步骤中加入抗恩拉霉素抗体为含有抗恩拉霉素抗体的血清。3.根据权利要求2所述的检测肉制品中恩拉霉素残留的方法，其特征在于:a步骤中所述的预包被恩拉霉素抗原的包被浓度为2.30ug/mL, b步骤中加入的含有抗恩拉霉素抗体的血清的稀释度为1:10000。4.根据权利要求1所述的检测肉...
【专利技术属性】
技术研发人员：严玉宝，余华，叶健强，廖党金，胡娟，谢晶，崔鹏博，周岷江，
申请(专利权)人：中华人民共和国四川出入境检验检疫局，四川省畜牧科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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