内质蛋白的抗体及其用途制造技术

本文公开了特异性结合内质蛋白的分离的单克隆抗体。在某些实施方案中，这些抗体是完全人源性的。本文还公开了编码这些抗体的重组核酸、包括这些核酸的表达载体和用这些表达载体转化过的宿主细胞。在几个实施方案中，所公开的抗体可用于检测和/或治疗表达内质蛋白的肿瘤，例如黑素瘤、乳癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、肺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、卵巢癌或胰腺癌。在一个实例中，所述肿瘤是黑素瘤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抗体领域，具体涉及特异性结合内质蛋白的完全人源性抗体(fullyhuman antibody)。
技术介绍
黑素瘤是攻击性的、频繁转移性肿瘤，其源自黑素细胞或黑素细胞相关的痣细胞(Cellular and Molecular Immunology(1991) (eds.) Abbas A. K. , Lechtman, A.H. , Pober, J. S. ;ff. B. Saunders Company, Philadelphia:第 340-341 页)。黑素瘤占全部皮肤癌症的大约3%，在全世界妇女中黑素瘤的增加未被除肺癌外的任何其他的新生物所超过(Cellular and Molecular Immunology^(1991)(eds. ) Abbas, A. K. , Lechtiman, A.H. , Pober, J.S. ;ff. B. Saunders Company Philadelphia:第 340-342 页;Kirkwood andAgarwala(1993)Principles and Practice of0ncology7:1-16)。甚至当黑素瘤表面上局限于皮肤时，也有最高达30%的患者将发生全身转移，大多数将死亡(Kirkwood andAgarwala(1993)Principles and Practice of 0ncology7:1-16)。治疗黑素瘤的经典方式包括手术、辐射和化学疗法。在过去的十年中，免疫疗法和其他分子方法已经作为新的且有前景的治疗黑素瘤方法浮现出来。黑素瘤沉积物存在淋巴细胞，提供了有力证据表明在人体中存在癌症免疫反应。当被分离后，这些淋巴细胞能够以主要组织相容性复合体(MHC)-限制方式识别特异性的自身肿瘤抗原和同种异体的黑素瘤(Itoh et al. (1986)，CancerRes. 46:3011-3017;Muul et al. (1987),J.1mmuno1. 138:989-995) ;Topalianet a1. ( 1 9 8 9)J.1mmunol. 142 : 3714-3725;Darrow et a1. ( 1 989)J.1mmunol. 142:3329-3335;Horn et al. (1991)J. Tmmunother. 10:153-164;Kawakami etal. (1992) J.1mmunol. 148:638-643;Horn et al. (1993)J.1mmunother. 13:18-30;0'Neilet al. (1993) J.1mmunol. 151:1410-1418)。转移性黑素瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在体外可识别共有的抗原，包括黑素细胞-黑素瘤系特异性组织抗原(Kawakami etal. (1993)J.1mmunother. 14:88-93;Anichini et al. (1993)J. Exp. Med. 177:989-998)。许多黑素瘤患者产生针对这些肿瘤的细胞和体液免疫反应以及黑素瘤表达MHC抗原和肿瘤相关抗原(TAA)的事实，暗示鉴定和表征额外的黑素瘤抗原对于免疫治疗黑素瘤患者将是重要的。但是，还需要新的方式来治疗黑素瘤和其他癌症。
技术实现思路
本文公开了特异性结合内质蛋白(Grp94)的分离的单克隆抗体以及这些抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中这些抗体是完全人源性抗体。这些抗体对人内质蛋白有高亲和力并可以用于治疗和/或诊断癌症。在一个实例中，所述单克隆抗体是scFv。在某些实施方案中，所公开的抗体可用于检测表达内质蛋白的肿瘤，例如黑素瘤、乳癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、肺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、卵巢癌或胰腺癌。在其他实施方案中，所公开的抗体可用于治疗肿瘤，例如黑素瘤、乳癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、肺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、卵巢癌或胰腺癌。本文还公开了编码这些抗体的重组核酸、包括这些核酸的表达载体和用这些表达载体转化过的宿主细胞。上述的以及其他的特征和优势通过以下几个实施方案的详细描述会更清楚，详细描述参照附图进行。附图说明图1a.用人黑素瘤细胞系丽1158淘选噬菌体展示scFv文库。所述噬菌体展示scFv文库含有大量的有不同特异性的噬菌体展示scFv片段。将所述文库加入到含有WMl 158黑素瘤细胞悬液的管中。然后洗涤所述管以移除未结合的噬菌体，在高PH下洗脱结合的噬菌体并在细菌宿主大肠 杆菌TGl中扩增。然后进行三轮淘选，用培养的人LG2B淋巴样细胞吸收所分离的克隆以移除结合到人黑素瘤细胞和淋巴样细胞共有的抗原(Ag)的噬菌体。然后用WMl 158细胞通过ELISA (酶联免疫吸附测定)对所分离的噬菌体进行反应性筛选。图1b.通过用WMl 158细胞淘选噬菌体展示抗体文库而分离的scFv W9与所述黑素瘤细胞系丽1158和所述B淋巴样细胞系LG2的差异反应性。将丽1158细胞铺于96孔板并与scFv W9在室温孵育2小时。使用c-myc特异性mAb (单克隆抗体)9E10和HRP-链酶亲和素检测scFv的结合。识别无关抗原和LG2细胞的scFvll9被用作阴性对照。scFvW9特异性地与WMl 158细胞系反应。图2. scFv W9与多种类型人细胞系的反应性。6种黑素瘤细胞系、4种乳癌细胞系、头颈部鳞状细胞癌细胞系、3种胰腺癌细胞系、膀胱癌细胞系、肺癌细胞系、上皮癌细胞系、结肠癌细胞系、肾癌细胞系、前列腺癌细胞系和卵巢癌细胞系被铺于96孔板并与scFvW9在室温孵育2小时。使用c-myc特异性mAb9E10和HRP-链酶亲和素检测scFv的结合。scFv W9与所有黑素瘤细胞系、2种乳癌细胞系、头颈部鳞状细胞癌细胞系、胰腺癌细胞系、膀胱癌细胞系、肺癌细胞系、上皮癌细胞系、肾癌细胞系、卵巢癌细胞系和神经胶质瘤细胞系都有反应。图3a和3b.内质蛋白被鉴定为scFv W9识别的抗原。WM1158黑素瘤细胞裂解物与scFv W9进行免疫沉淀。使用I类HLA-特异性mAbTP25. 99和HMW-MAA特异性scFvC21作为对照。在还原性的10%SDS-PAGE上分辨所述沉淀物中的蛋白质并用考马斯蓝染色。94-KDa是所述W9沉淀所特有的(A)。从T24 (膀胱癌)、SUM149 (乳癌)和SLR21 (肾癌)细胞系的裂解物获得了相同的结果。从所述SDS凝胶切离所述特异性条带并通过质谱分析。在94-KDa条带中鉴别到的人蛋白为内质蛋白。图4.碳水化合物在scFv W9识别的决定簇的表达中的作用。将C0L038细胞在存在0. 5 ii g/ml衣霉素的情况下培养72小时。在只加入DMSO的培养基中孵育细胞并使用所述mAb TP25. 99作为对照。通过ELISA检验细胞与scFv W9的结合。细胞与scFv W9在4°C孵育2小时。使用mAb9E10和HRP-山羊抗小鼠IgG抗体检测scFv的结合。在450nm处读出吸光度，衣霉素处理诱导了 scFv W9与C0L038细胞的结合的强烈下降。因此，碳水化合物在scFv W9识别的决定簇的表达中起作用。图5a和5b. scFv W9对重组犬内质蛋白(Grp94)的反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.16 US 61/355,5161.一种分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括SEQ ID NO:1的氨基酸 26-33 (CDRl)、SEQ ID NO:1 的氨基酸 51-58 (CDR2)、SEQ ID NO:1 的氨基酸97-103 (CDR3)，或其两者或三者的组合，并且其中所述抗体特异性结合人内质蛋白。2.权利要求1所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包括SEQIDNO: 2 的氨基酸 27-32 (CDRl)、SEQ ID NO: 2 的氨基酸 50-52 (CDR2)、SEQ ID NO: 2 的氨基酸89-97 (⑶R3)，或其两者或三者的组合。3.权利要求1-2任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体的重链可变域包括SEQ ID NO:1 的氨基酸26-33 (CDRl)、SEQ ID NO:1 的氨基酸51-58 (CDR2)、SEQID NO:1的氨基酸97-103 (CDR3)，并且所述抗体的轻链可变域包括SEQ ID NO:2的氨基酸27-32 (CDRl)、SEQ ID NO: 2 的氨基酸 50-52 (CDR2)和 SEQ ID NO: 2 的氨基酸 89-97 (CDR3)。4.权利要求1-3任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体的重链包括 SEQ ID NO:1。5.权利要求1-4任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体的轻链包括 SEQ ID NO:2。6.权利要求1-5任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体的重链包括SEQ ID NO:1，并且所述抗体的轻链包括SEQ ID NO:2。7.权利要求1-6任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab) ’ 2片段、单链Fv蛋白(scFv)或二硫化物稳定的Fv蛋白(dsFv)。8.权利要求7所述分离的人单克隆抗体抗原结合片段，其中所述抗体是scFv。9.权利要求1-8任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是IgG010.权利要求1-9任一项所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是经标记的。11.权利要求10所述分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述标记是荧光标记物、酶标记物或放射性标记物。12.—种组合物，包括权利要求1-11任一项所述分离的抗体或抗原结合片段和可药用载体。13.一种分离的免疫缀合物，包括连接到效应分子的权利要求1-9任一项所述人单克隆抗体或抗原结合片段。14.权利要求13所述分离的免疫缀合物，其中所述效应分子是假单胞菌(Pseudomonas)外毒素(PE)或者其变体或片段。15.一种组合物，其包括权利要求14所述分离的免疫缀合物和可药用载体。16.一种治疗被诊断为患有...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·费龙，X·王，T·P·康拉茨，E·菲沃伊诺，B·胡德，
申请(专利权)人：高等教育联邦系统匹兹堡大学，
类型：
国别省市：