胎盘蛋白质13的抗体制造技术

公开了一种可结合胎盘蛋白质１３（ＰＰ－１３）的单克隆抗体（Ｍａｂ）。同时公开了产生Ｍａｂ的杂交瘤克隆，用Ｍａｂ测定生物液中ＰＰ－１３水平的免疫测定法、以及在生物液中测定ＰＰ－１３水平的试剂盒。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种针对胎盘蛋白质的抗体。妊娠管理的目的是出生成熟、健康的婴儿，不产生对母体和新生儿健康有不良影响的并发症。相当多的妊娠受多种紊乱影响。其中有早产、子宫内发育迟缓和先兆子痫。这些并发症对所影响的妊娠造成负面影响，这对患者及健康保障系统都是花费巨大的。胎盘蛋白质13(PP-13)是以前从人胎盘组织分离的一种蛋白质(U.S.4,500,451 Bohn等人，其中内容在此处引用以供参考)。该蛋白质用以下参数表征电泳迁移率、等电点、沉降系数、超离心测定的分子量、SDS-PAGE电泳测定的分子量、消光系数和糖含量。已测定了其氨基酸组成(每100个残基中每种氨基酸的残基数)，但尚未测定其氨基酸序列。PP-13曾用于对三种特定妊娠相关的紊乱子宫内发育迟缓、先兆子痫和早产进行早期检测(U.S.5,198,366 Silberman等人，其中内容在此处引用以供参考)。已分别开发了用标记的PP-13和抗PP-13多克隆抗血清进行了放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。但是只有RIA给出了实验结果，ELISA还没有给出实验结果。在Silberman专利中未进一步公开PP-13的特性。关于其它胎盘蛋白质的确定及它们与妊娠紊乱的关系在文献中也有报道(1-3)。ELISA满足了对其客观性、简单性、敏感性和以前只有放射免疫测定(4)才能达到的特异性的需要。通过对ELISA和RIA进行方法比较，揭示了前一种方法的诸多优点；1.ELISA绝对安全，不需要特别设计的实验室和经过培训的与放射活性物质打交道的工作人员。2.双抗体夹心ELISA是一种更加敏感、快速且易于定量的方法。3.与放射活性示踪剂相比较，酶相当稳定并且具有高水平的结果可重复性。4.利用ELISA-读数仪的分光光度原理易于测定酶活性。ELISA-读数仪比γ-计数器廉价且易于操作，5.ELISA更适于自动化。因此希望开发用于测定PP-13水平的改良ELISA。本专利技术进一步的一个目的是提供测定生物液中PP-13水平的免疫测定法。本专利技术的一个方面是提供可结合PP-13的Mab。特别是，本专利技术提供了选自克隆#26-2、27-2-3、215-28-3、534-16和606-8-11-67的杂交瘤克隆，以及由这些克隆产生的Mab。根据布达佩斯条约，这些克隆保藏在位于法国，巴黎，Rue du Docteur Roux 25，巴斯德研究所的国立微生物保藏中心(CNCM)。克隆的详细保藏资料如下 本专利技术的另一个方面是提供测定生物液中PP-13水平的免疫测定法，包括以下步骤(a)将生物液与根据本专利技术的Mab接触，由此形成Mab-PP-13复合体；(b)将复合体暴露于连接至信号产生分子的二级抗体，该二级抗体能结合此复合体；以及(c)提供利于此信号产生分子产生信号的条件。在本说明书中，术语“信号产生分子”涉及能直接或间接产生可检测信号的分子。例如，信号可以是放射活性的发射，或者是在特定波长下的分光光度吸收。优选地，信号为可被分光光度测量仪检测的颜色。例如信号产生分子可通过自身与生色底物作用直接产生信号，或者通过与另一个可产生信号的分子结合，从而间接产生信号。在一个优选的实施方案中，信号产生分子是一种配体，其通过与连接至一种酶的配体结合分子结合，接下来催化导致颜色形成的反应，从而间接产生信号。生物液可以是任何含有PP-13的液体，如胎盘提取物或者血清。优选的液体为血清。在本专利技术这方面的一个实施方案中，与PP-13上一个位点结合的Mab被结合于固相上，如微量滴定孔或珠。二级抗体可与PP-13上的另一个位点结合，它可以是多克隆或单克隆。在一个优选的实施方案中，二级抗体也是一种本专利技术的Mab。本专利技术进一步的一个方面是提供测定生物液中PP-13水平的试剂盒，它包含(a)根据本专利技术的Mab；(b)与信号产生分子连接的二级抗体；以及(c)PP-13标准液。在一个优选的实施方案中，如上所述，二级抗体也是一种Mab。该试剂盒可用于进行上述的免疫测定。附图说明图1显示了小鼠抗PP-13腹水&IgG的SDS-PAGE电泳图(为显现杂质，凝胶是过载的)；图2阐明用直接ELISA检测小鼠抗PP-13血清；图3阐明用直接ELISA对抗PP-13抗体的分类；图4&5阐明用夹心ELISA检测抗PP-13抗体；图6-9阐明用直接ELISA对抗PP-13抗体的分类(克隆二筛)；图10阐明用直接ELISA对抗PP-13抗体的分类(克隆三筛)；图11阐明不同组合的双单克隆抗体夹心ELISA；图12显示了PP-13 ELISA的标准曲线(单克隆夹心)；图13阐明PP-13 ELISA的灵敏度(单克隆夹心)；图14阐明了PP-13在血清中的稀释曲线(单克隆夹心ELISA)；以及图15阐明了PP-13分析复原检验(单克隆夹心ELISA)。优选的实施方案详述材料和方法(a)PP-13的纯化对Bohn等人描述的方法加以改进后，从人胎盘分离和纯化本研究所用的PP-13。新鲜获得的胎盘剥去膜和母体外层物，将内胎滋养层区切成小块，置于搅拌器中用约1.5升的DDW匀浆5min。接下来的所有步骤均在4℃进行。加入几滴浓缩NaOH，将提取物的pH调节至7.0。然后，将提取物用组织匀浆器(Politron)再匀浆5min，每批300ml。将匀浆后的胎盘提取物搅拌30min，然后10,000转每分(Sorval大转头)离心60min。保留上清，补加0.5M NaCl、100mM Tris-HCl、0.05％Tween 20和0.1％NaN3，用真空泵通过深层滤器过滤，收集含有PP-13的滤液用作第一免疫吸附柱，贮存于-20℃。用缓冲液A(1M NaCl、100mM Tris-HCl、0.1％NaN3，pH8.0)平衡60ml床体积的包含兔抗PP-13 IgG级分的抗PP-13免疫吸附柱(I)。该柱足以处理一个胎盘提取物。胎盘提取物以4ml/min的流速上样至柱，用缓冲液A洗脱，直至光密度(OD)水平达到基线。用6M尿素溶液(用1mg/10ml的安伯来特离子交换剂MB-6，20-50目处理)从柱洗脱PP-13峰。洗脱下来的蛋白质溶液(约150ml)用10 kD MW截断盘膜超滤浓缩至终体积50ml。同时，将缓冲液切换为磷酸盐缓冲液(PBS)，其中含有0.1％NaN3，pH7.4。用PBS+0.1％NaN3，pH7.4平衡60ml床体积的包含兔抗人胎盘提取物IgG级分之抗胎盘提取物反向免疫吸附柱(II)。从柱I获得的富含PP-13的提取物以3ml/min的流速上样至柱。收集未结合的蛋白质(约130ml)，用10kD MW截断盘膜浓缩至终体积40ml。用6M尿素溶液去除与柱结合的杂质，使柱再生，并且用5倍床体积的PBS+0.1％叠氮钠洗。用PBS平衡56ml床体积的包含兔抗人α-1、β-和δ-球蛋白IgG的抗人球蛋白反向免疫吸附柱(III)。从柱II获得的浓缩PP-13提取物以3ml/min的流速上样至柱III，收集未结合的蛋白质(约120ml)。用6M尿素溶液使柱再生，并且用PBS洗。用第一个免疫吸附柱再纯化此物质，然后用Superdex 75 Hiload 26/60柱凝胶过滤层析本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可结合胎盘蛋白质１３（ＰＰ－１３）的单克隆抗体（Ｍａｂ）。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：Y帕尔提耶利，L拉比诺维特奇，
申请(专利权)人：诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：IL[以色列]