蛋白质及其制备方法，ＡＤＮ的顺序，抗体及其用途，痘病病毒，被转化或感染染的细胞**技术

本发明专利技术旨在制备抗血吸虫病的疫苗，它涉及一个包括蛋白质Ｐ－［２８］的抗原决定基的蛋白质，一个包括为该蛋白质进行密码的基因的痘病病毒，一个并入该蛋白质的表达载体的细胞，该蛋白质的制备方法，一个为蛋白质Ｐ－［２８］密码的ＡＤＮ的顺序，药剂组合物，抗该蛋白质的抗体及其作为诊断血吸虫病的药剂的用途。本发明专利技术还涉及该蛋白质作为谷胱甘肽—Ｓ—转移酶活性的显示剂的用途。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及制备抗血吸虫病的疫苗。血吸虫病(或者住血吸虫病)是遍及热带和亚热带地区的危害人类地寄生虫所造成的疾病(除了北美地区以外)，这种疾病同样蔓延到北非洲，並在埃及严重扩延在西班牙和葡萄牙也有所发现。这种疾病影响了世界上2-4亿的人口，能造成血吸虫病的寄生虫是形状较小的扁平的蠕虫，其中通过淡水软体动物作为中间宿主以进行其生命的再生循环。由此可见，这种疾病能随着热带地区开发灌溉渠网和河坝而扩延。我们知道造成人类血吸虫病的病原体有五种最广泛流行的是曼蚊血吸虫病(S.mansoni)，它一般在非洲和美洲蔓延;还有两种，即住血吸虫病(S.haematobium)和插入血吸虫病(S.intercalatum)，它们一般多发现于非洲;另外的两种是日本血吸虫病(S.japonicum)和湄公血吸虫病(S.mekongi)，一般多发现于亚洲。我们有必要了解和掌握寄生虫的生活习性，以便能制定防止这种疾病的整体战略。实际上，寄生虫几乎完全适应宿主的天然防御当其成年时，它能完全躲避免疫机构，並在靠近肠壁的血管或膀胱中生存5-20年(指曼蚊血吸虫或住血吸虫)寄生虫在人体中不再生繁殖，但雌虫每天能产下3000个卵。这些虫卵和寄生虫新陈代谢的排泄物不断出现于宿主的循环机构中，从而导致各种紊乱(肠系统紊乱，输尿系统紊乱，全身虚弱，贫血，肉芽肿及毛细血管堵塞，从而导致组织的纤维织炎和严重的肝炎)。具有距的这些卵能穿透肠壁和膀胱壁，並在其中造成了微小的损伤，然后被排泄出去。如果它们能较快地接触到水，它们就在水中变成纤毛幼虫(纤毛蚴)，並在水中游动直至穿入软体动物内。在这中间宿主中，幼虫继续不断地进行无性繁殖，生产出能在水中自由游动的许多尾蚴(被单个纤毛蚴染污的软体动物，在8-10个月生存期中能生产出50000以上的尾蚴)。尾蚴是只能生存1-2天的浮生幼虫，当它迂到哺乳动物，尤其是人体时，能穿透皮肤。在皮肤中，它能转变成血吸虫蚴体，即未成熟的寄生虫，然后随着人体的血循环相继地传到心脏、肺，並最终达到肝脏，就是在肝脏循环系统中这些蚴体变成了成虫。雄虫与雌虫在其中交配，雌虫定居于由雄虫的躯体合拢所构成的沟渠中，这对雌雄结合体最终定居于人体腹部的血管中，其中雌虫开始产卵了。使血吸虫蚴体完全成熟变成一个成虫，需要半个月的时间。在成虫阶段，寄生虫是吸附在宿主的分子表面上，借助这种掩敝，使它能逃躲免疫的识别和保护机构。此外，寄生虫本身分泌出能够抑制免疫的物质。每一对血吸虫在其宿主中能生存若干年，並且每天能产下数以千计的虫卵。现有一种抗成年寄生虫的有效药物，即吡喹酮，但是其价格太昂贵，以致于不可能考虑在发展中国家普遍使用之。而且这种药也不能作为防止再传染的预防药。然而，在病染地区，当地居民则往往是接触到受这些幼虫染污的水。因此，预防这种疾病的最大希望只能寄托在制备能抗未成年寄生虫，即血吸虫蚴体的有效疫苗上。这种疫苗应该可用于儿童以预防初级传染，並且能用于已染上疾病，並用吡喹酮药治疗过的病人，以避免再次被传染。这种疫苗应该包含一种或多种重要的血吸虫蚴体的抗原，而且应能诱导一种有效的免疫反应，以使幼虫在未逃躲宿主的保护机构前能被治住。当前的研究工作(请阅1985年的Capron和Dessaint评论)能够鉴别出数量有限的出现在寄生虫及其幼虫表面上的蛋白质抗原，而且它们在诱导免疫性反应方面扮演了重要的角色。1985年Balloul等人阐明了其中之一的上述抗原在用由凝胶提纯的曼蚊血吸虫病提取物对老鼠实施免疫以后，诱导抗体能识别出一种被称作P28的28Kd抗原，它是出现在寄生虫的幼虫和成虫上。这些相同的抗体能识别活体外的寄生虫的RNAm提取物的转译产物和血吸虫蚴体中被标记为1125I的一个外蛋白质。这些抗体，抗-P28虽然本身不能中和血吸虫蚴体，但能激活细胞毒的细胞反应，从而能杀死血吸虫蚴体。把提纯的蛋白质P28接种到试验用的大鼠和小鼠身上。这些免疫过的动物，在试验过程中具备高度的保护作用，以抗血吸虫蚴体的传染(Balloul等人，1986年)。上述试验表明了抗原P28具有重要的诱导保护性免疫反应的作用。本专利技术涉及CADN顺序的鉴别和测定，该顺序是为抗原P28或至少为一个多肽密码的，该多肽包含P28的抗原决定基，这些抗原决定基被用于抗天然的蛋白质P28的抗体所识别。这就是为什么本专利技术首先涉及如图1所示的为成熟蛋白质P28密码的ADN顺序。本专利技术同样涉及一种蛋白质，其中的合成是被CADN所操纵，该合成可以在不同的宿主细胞、细菌、酵母或超细胞中进行，这取决于CADN被插入的载体和它所属的表达的控制信号。据本专利技术的蛋白质能表现出与出现在血吸虫蚴体的天然蛋白质P28相同的一级结构。然而它也可以是后者(即天然蛋白质P28)的衍生物，或是不完全的蛋白质P28，然而它包含用于被抗体识别的，因而用于诱导免疫的重要的抗原决定基。这种蛋白质或不完全的蛋白质，还能被融合到别的蛋白质上(或蛋白质的片段)，这可依据相应的ADN片段的基因操作法，以便有助于宿主细胞中的蛋白质的更好的表达或诱发其排出细胞外。本领域技术人员已知，在各种不同宿主细胞中的外来基因的表达和克隆(无性繁殖)的工艺技术。这些工艺将在以后的实例中叙述，不过还可能用上其它的载体和其它的宿主细胞。在E.coli(大肠杆菌)的情况下，在细菌中的P28基因的表达是采用含有启动子λPL和CⅡrbs作为核糖核蛋白体的固定部位的载体而取得的。所得的杂种蛋白质包含一段蛋白质CⅡ和蛋白质P28，或者一段蛋白质P28。在宿主是酵母的情况下，例如，啤酒酵母(S.cerevisiae)，可以采用酵母的质粒载体，其在酵母中包含有一个功能性的复制原点，例如质粒2μ的复制原点和如URA3的选择基因。在这种情况下，所用的启动子是基因PGK的启动子，即部位5′的PGK基因，它能导致一个融合蛋白质，或者一个成熟的蛋白质。当宿主是哺乳动物的细胞时，最好采用痘病病毒作为表达载体，例如疫苗的病毒，其中为蛋白质密码的基因，在基因的表达顺序的操纵下被痘病病毒所安置。这重组病毒包含为本专利技术的蛋白质密码的基因，它最好是被插入在疫苗的TK基因中，並处于强的启动子，如疫苗的7.5K蛋白质的启动子的操纵下。为本专利技术的蛋白质密码的基因同样可被融合到一个为功能性信号顺序密码的区域，例如白氨酸(interleukine)或狂犬病的糖蛋白质的信号顺序，以确保使蛋白质排出细胞外，在这种情况下相应的蛋白质是包含一部分非来源于血吸虫蚴体的蛋白质的杂种蛋白质。为本专利技术的蛋白质密码的基因同样可以被融合到为狂犬病的病毒的糖蛋白质的跨膜带密码的区域中，以确保使蛋白质固定在受染细胞的细胞质膜中。本专利技术同样涉及被本专利技术的蛋白质的表达载体所转化的宿主细胞，以及该蛋白质的制备方法，其特点是据本专利技术培养这些宿主细胞並回收这些蛋白质。当然，本领域技术人员已知取决于宿主的蛋白质的培养、回收和分离方法。本专利技术还最终涉及用于抗血吸虫病的疫苗的药剂组合物，其特点至少在医药上可接受的载体中包含有据本专利技术的痘病病毒或蛋白质。本专利技术特别涉及活的疫苗，其特点它们包含表达据本专利技术蛋白质的活的重组疫苗的病毒，而且可用于在医药上可接受的载体中。这些疫苗最好是制成药用的方式，例如注射剂，而医药上可接受的载体可以是用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有被用于抗天然蛋白质Ｐ２８的抗体所识别的蛋白质Ｐ２８的抗原决定基的蛋白质。

【技术特征摘要】
FR 1986-8-22 8611986;FR 1987-4-22 8705691;FR 1987-1、一种含有被用于抗天然蛋白质P28的抗体所识别的蛋白质P28的抗原决定基的蛋白质。2、据权利要求1的蛋白质，其特征在于涉及到一个包含一部分非来源于血吸虫蚴体的蛋白质的杂种蛋白质。3、据权利要求1-2中之一的蛋白质，其特征在于含有蛋白质P28的完整顺序。4、据权利要求1的蛋白质，其特征在于它是一个其合成是被图16中的CADN所操纵的蛋白质或是这CADN的一个片段，该蛋白质是被用于抗天然蛋白质P28的抗体所识别。5、据权利要求1-4中任一的蛋白质，其特征在于它是由细菌所制得的。6、据权利要求1-5中任一的蛋白质，其特征在于它是由酵母或细胞培养所制得的。7、并入据权利要求1-6中任一蛋白质的表达载体或阻断的细胞。8、据权利要求7的细胞，其特征在于涉及一个细菌，该细菌在细菌启动子的操纵下，被包含为据权利要求1-5中任一的蛋白质密码的基因的质粒所转化。9、据权利要求7的细胞，其特征是涉及一个酵母，该酵母在酵母启动子的操纵下，被包含为据权利要求1-4或6中任一蛋白质密码的基因的质粒所转化。10、据权利要求8或9中之一的细胞，其特征是可进行密码的基因是由图16中的CADN的整个顺序或部分顺序所组成。11、痘病病毒，其特征是它包含一个为据权利要求1-4中任一个蛋白质密码的，并在能够表达基因的成分的控制下被痘病病毒安插的基因。12、据权利要求11的痘病病毒，其特征在于该痘病病毒是疫苗的病毒。13、据权利要求12的痘病病毒，其特征是能够表达基因的这些成分包括疫苗的7.5K基因的病毒性启...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗桑德米耶尔，简马克巴鲁尔，雷蒙德彼尔斯，简马里格茨奇，马里保罗基尼，格拉德洛森，安德里卡普罗恩，简彼里利科，
申请(专利权)人：特朗斯吉恩有限公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]