一种PRP核糖提取方法技术

本发明专利技术涉及B型流感嗜血杆菌聚核糖基核糖醇磷酸酯纯化方法，该方法包括以下步骤：(1)从B型流感嗜血杆菌发酵液中去除菌体得到发酵液上清；(2)从发酵液上清中去除核酸和蛋白，得到PRP多糖。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种PRP核糖的制备方法。
技术介绍
B型流感嗜血杆菌(Hib)是引起婴幼儿脑膜炎、中耳炎的主要致病因子，荚膜是B型流感嗜血杆菌的主要毒力因子，主要成分是核糖基核糖醇磷酸酯(PRP)重复单元。研究发现抗PRP多糖的抗体可有效的降低Hib的感染，为此基于PRP的多糖疫苗或者结合疫苗已经成为预防Hib感染的主要方法。Hib结合疫苗是世界上开发最早、也是最为成功的结合疫苗，此类结合疫苗的成功开发解决了多糖疫苗不能有效激发婴幼儿免疫反应的缺点，随着结合疫苗的技术发展，现在已经有多家制药企业研发了不同类型的Hib结合疫苗；B型流感嗜血杆菌PRP多糖属于Hib细菌荚膜组分之一，故有称之为Hib荚膜多糖，主要成分为磷酸化的核糖基核糖醇，用英文表述为polyribophosphate,简写为PRP,有文章用聚核糖基核糖醇磷酸酯来表述其主要的成分，也有文章用磷酸多核糖核醇来表述；总之,Hib荚膜多糖、PRP多糖、PRP核糖、polyribophosphate、聚核糖基核糖醇磷酸酯、磷酸多核糖核醇均指同一物质，在此篇文章中都指来自于Hib培养液纯化得到的荚膜多糖，文章中通常用PRP多糖来书写。获取纯化的PRP多糖是研制Hib结合疫苗的基础，传统的PRP多糖提取方法如下首先是收集十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀的发酵液中的复合多糖，之后乙醇沉淀收集粗制多糖，或超滤浓缩后乙醇沉淀，取上清，然后加入适宜浓度的乙醇溶液沉淀多糖，并依次用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物，干燥后即为粗制多糖。将粗制多糖溶解于1/10饱和醋酸钠溶液中，然后按适当 比例用冷酚溶液重复抽提数次。收集上清液，并透析或超滤脱酚，再加乙醇至最终浓度为60% -80%，离心后收集沉淀物，或超滤浓缩后乙醇沉淀，取上清，然后加入60% -80%的乙醇溶液沉淀多糖，依次用无水乙醇、丙酮离心洗涤，真空干燥，所得固体即为精制多糖。传统的PRP多糖提取方法繁琐，回收率低，而且大量使用苯酚、丙酮等有机试剂，这些有机试剂对环境造成潜在的影响；此外，CTAB沉淀PRP核糖因涉及到沉淀是否完全对发酵以及浓缩的批次一致性提出更高的要求，当然采用苯酚抽提蛋白这个工艺存在放大困难，反复操作的弊端。本专利技术在Hib结合疫苗的生产过程中采用了新的PRP多糖提取方法，此提取方法不仅有别于传统的PRP多糖提取方法，而且更为简捷、可以迅速放大，此外也避免了传统方法中的多种化学试剂存在的潜在污染。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从B型流感嗜血杆菌(Hib)发酵液中提取PRP多糖的生产工艺。从Hib发酵液中制备PRP多糖，重点考虑三个策略，其一是提取特异性的PRP多糖，其二是降低蛋白和核酸的百分含量，最后是尽量的避免引入外源物质。因此，优先考虑过程简单、易于放大的纯化工艺；采用现在高速发展业已成熟的纯化设备和方法，优先考虑安全性高、工艺稳定的纯化设备和方法。根据本专利技术的方法，该方法包括(I)从B型流感嗜血杆菌发酵液中去除菌体得到发酵液上清；(2)从发酵液上清中去除核酸和蛋白，得到PRP多糖。根据本专利技术的方法，其中步骤(I)去除菌体沉淀得到发酵液上清可以采用本领域任何常用的或者常规的方法，优先采用离心的方法，例如可选择8000转/分钟(rpm)离心20min,也可选择 12000rpm 离心 lOmin。按照以上步骤(I)的方法得到的发酵液上清可以直接进行步骤(2)，也可以浓缩发酵液上清再进行步骤(2)，还可以过滤发酵液上清再浓缩。优选的是过滤后浓缩发酵液上清。本专利技术的步骤(2)采用以阴离子介质装填的色谱柱去除蛋白和核酸类杂质。其中所述的阴离子介质优选强阴离子介质Q-sepharose。Q-sepharose介质同时可以吸附发酵液上清中的部分蛋白和核酸以及几乎全部的PRP多糖，采用Q-s印harose介质的洗脱条件可以通过调节PH或者离子强度或者同时调节PH和离子强度达到。 本专利技术优选用调节离子强度来洗脱Q-sepharose的吸附物。本专利技术的柱层析步骤如下首先用4倍体积的A液(A液0. 5*PBS,电导1. 77ms)平衡Q-sepharose柱,平衡Q-sepharose柱的过程中同时用OD28tl和OD2tl6以及电导曲线来监测柱子平衡情况,待OD28tl和OD2tl6吸收曲线与基线持平，电导曲线显示的电导率和A液一致(1.77ms)时开始上样，分离PRP多糖,一般4倍柱体积的A液可以完全平衡Q-sepharose柱满足上样条件。优选通过上样阀进入Q-sepharose柱(Q-sepharose柱大小为16*20cm,由GE公司提供)，同时监控OD28tl和OD2tl6吸收来观察穿透液中蛋白质和多糖的含量。上样结束后用6倍柱体积的A液洗涤未被结合的蛋白、核酸以及多糖等其他杂质，同时监控OD28tl和OD2tl6吸收，优先洗脱至OD28tl和OD2tl6吸收峰与基线持平，6倍柱体积的A液即可。随后用B液(B液0. 5*PBS+2M NaCl)分梯度洗脱，用低浓度的B液(28%的B液)洗脱蛋白和核酸等，高浓度的B液(100% B液)洗脱多糖。优选的先用6倍柱体积的28%的B液洗脱Q_s印harose柱，弃去洗脱液，再用6倍柱体积的100%的B液洗脱Q-sepharose柱，收集洗脱液。本专利技术的发酵液上清通过上样阀进入Q-s印harose柱的过程中，通过监控OD28tl和OD2tl6吸收来观察穿透液中蛋白质和多糖的含量，OD280是蛋白质的特异性吸收波长，荚膜多糖没有特异性的吸收波长，一般通过OD28tl和OD2tl6吸收峰的差别来判断溶液中荚膜多糖的含量高低，当穿透液中存在较高浓度的荚膜多糖或者OD2tl6的吸收峰比较高的时候，说明Q-sepharose已经满载，此时停止上样，通常离子交换介质的吸附量通常比较高，一般情况16*20的Q-s印harose阴离子交换柱可完全满足2L发酵液上清中PRP核糖的纯化。本专利技术通过Q-sepharose的分步洗脱,达到以下目的其一，除去发酵液中的大量蛋白、核酸等其他杂质，其二，浓缩了发酵液上清中的PRP核糖。优选的在步骤(2)之前还包括浓缩发酵液上清的步骤。浓缩发酵液上清的主要目的是缩小上样前的体积，节约上样时间，浓缩发酵液上清可以采用任何本领域常用的或常规的实验方法，优先采用膜包超滤浓缩，超滤膜包选用Millipore公司的PVDF材质构成的膜包，膜包大小为50KDa。通常浓缩后的体积为浓缩前发酵液上清的二十分之一，超滤浓缩设备为millipore公司的，膜包的大小依实验目的物决定，用于Hib荚膜多糖提取的超滤膜包通常选用50KDa，超滤浓缩方法为本领域常见的实验方法，超滤浓缩至预定体积后，可以直接进行后续的实验，也可以选用PBS反复洗涤发酵液，目的是除去发酵液中的部分蛋白质和核酸，原因是蛋白质和核酸往往小于50KDa，因此在PBS缓冲液置换发酵液的过程中，部分蛋白质和核酸随透过液流出，可以选用50倍浓缩发酵液体积的PBS反复置换浓缩液，结果就是大部分核酸和蛋白质随透过液流出，浓缩液中主要组分为PRP多糖。本专利技术还包括，将发酵液上清在采用膜包超滤浓缩之前过滤的步骤。过滤可以采用任何本领域采用的方法，例如用O. 22u本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从Hib发酵液中制备B型流感嗜血杆菌PRP多糖的方法，其特征在于，该方法包括：(1)从B型流感嗜血杆菌发酵液中去除菌体得到发酵液上清；(2)从发酵液上清中去除核酸和蛋白，得到PRP多糖。

【技术特征摘要】
1.一种从Hib发酵液中制备B型流感嗜血杆菌PRP多糖的方法，其特征在于，该方法包括 (1)从B型流感嗜血杆菌发酵液中去除菌体得到发酵液上清； (2)从发酵液上清中去除核酸和蛋白，得到PRP多糖。2.根据权利I的方法，其特征在于，步骤(I)得到的发酵液上清可以直接进行步骤(2)，也可以浓缩发酵液上清再进行步骤(2)，还可以过滤发酵液上清，再浓缩再进行步骤⑵。3.根据权利I的方法，其特征在于，其中步骤(I)采用离心的方法去除菌体。4.根据权利2的方法，其特征在于，其中步骤(2)所述的浓缩发酵液上清用膜包超滤浓缩。5.根据权利I的方法，其特征在于，其中步骤(2)采用以阴离子介质装填的色谱柱去除蛋白和核酸类杂质。6.根据权利5的方法，其特征在于，其中所述的阴离子介质为强阴离子介质Q-sepharose07.根据权利6的方法，其特征在于，在采用阴离子介质去除蛋白和核酸类杂质之后，还要进行乙醇分布醇沉纯化的步骤。8.根据权利7的方法，其特征在于，在进行乙醇分布醇沉纯化的步骤之后，还要进行用凝胶介质进一步分离纯化的步骤。9.根据权利8的方法,其特征在于,其中所述的凝胶介质是sepharose4FF。10.根据权利9的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 (1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李军强，
申请(专利权)人：天士力制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：