一种氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡制造技术

本发明专利技术公开了一种氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡，包括衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、玻璃吸水垫，所述金标结合垫为吸附有胶体金标记的抗氯羟吡啶单克隆抗体或多克隆抗体玻璃纤维棉，在所述硝酸纤维素膜上有用氯羟吡啶-载体蛋白偶联物印制的隐形检测线，用山羊抗小鼠IgG印制的隐形对照线。本发明专利技术的胶体金层析检测试纸条和试纸卡具有下列各项优点：①特异性强，敏感性高。②简便、快速、时效性强。③结果显示形象、直观、准确。④节省费用，适用范围广，便于推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种快速检测微量氯羟吡啶的器具，特别是涉及一种饲料和动物源性食品中氯羟吡啶残留分析的胶体金层析检测试纸条或卡。
技术介绍
氯羟吡啶(CLOP)，商品名为克球酚，化学名为3，5-二氯-2，6-二甲基-4-羟基吡啶，是一种预防畜、兔球虫病的饲料药物添加剂，长期使用或不按规定用药会造成氯羟吡啶在动物体内和组织中残留，具有一定的致畸性和胚胎毒性。现在，欧盟、美国、加拿大、日本以及中国、中国台湾都规定了各种动物组织中氯羟吡啶残留最高限量标准。我国规定了氯羟吡啶在鸡肉中的残留限量为O. 01mg/kgo组织中氯羟吡啶的检测方法主要采用气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和气谱/质谱联用法(GC/MS)等。气相色谱相对麻烦，高效液相色谱法具有简便快速、灵敏的特点，成为分析鸡肉组织中氯羟吡啶残留的主要方法。我国规定了氯羟吡啶在鸡肉中的残留限量为O. 01mg/kg,而相应标准的检测限为O. 05mg/kg，无法满足检测要求。同时，在样品处理过程中，需先经葡聚糖凝胶阴离子交换柱去除干扰杂质，再过碱性氧化铝SPE柱，不仅过程繁琐，而且降低了的回收率。理化分析法灵敏度高，结果准确，但是样品需经一系列复杂的处理净化，繁琐费时，所需仪器设备价格昂贵，而且只有特定的专业技术人员才能操作，不能进行现场检测，时效性差，难以推广。酶联免疫吸附法(ELISA)法以竞争性酶联免疫反应为检测原理，反应显色后用酶标仪测定吸光值(OD)值进行结果判定。缩短了检测时间，可以对残留药物进行定性定量检测。但ELISA方法需要配套的酶标仪和配套试剂，操作过程仍较复杂，而且国内现处在研发阶段，进口国外产品价格昂贵，因而ELISA方法的应用受到了较大限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是研制出特异、敏感、快速、简便的氯羟吡啶残留胶体金层析检测试纸条和试纸卡。一种氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡，包括衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、玻璃吸水垫，所述金标结合垫为吸附有胶体金标记的抗氯羟吡啶单克隆抗体或多克隆抗体玻璃纤维棉，在所述硝酸纤维素膜上有用氯羟吡啶-载体蛋白偶联物印制的隐形检测线，用山羊抗小鼠IgG印制的隐形对照线。所述的氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡，所述的隐形检测线和隐形对照线平行排列组合为“ 11 ”。所述的试纸条或卡，所述金标物结合垫为将1: 100 1: 500稀释(体积比)的胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉中，4°c低温真空干燥，制备CLOP金标物结合垫。所述的试纸条或卡，所述胶体金标记抗体制备方法为将稀释后的胶体金和单克隆抗体或多克隆抗体按照不同的浓度倍比，选择胶体金显色红色的最小稀释浓度作为胶体金标记抗体的最佳量，用于胶体金标记抗体的制备。所述的试纸条或卡，所述单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法为Al、氯羟吡啶半抗原的改造亲核取代反应引入酯键，然后在碱、酸的作用下，合成含有羧基的氯羟吡啶半抗原；A2、CL0P-2C-载体蛋白人工抗原的合成采用活泼酯法合成CLOP人工免疫原，称取75mg CLOP半抗原溶解于3mL N, N-二甲基甲酰胺中，加入二环己基碳二亚胺35mg和N-羟基琥珀酰亚胺18mg，在室温下磁力搅拌反应过夜12h，此液为A ;称取20mgBSA溶于2mL0. 01mol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲液溶液中，此液为B ;将反应液B置于磁力搅拌器上，4°C下将反应液A缓慢滴加到反应液B中，搅拌反应过夜。次日将反应液置于经过预处理的透析袋内，在PBS中搅拌透析7天，得到偶联产物CL0P-2C-BSA，分装上清液，冻存于_20°C冰箱中，备用；A3、氯羟吡啶单克隆抗体和多克隆抗体的获得用CL0P-2C-BSA免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为50ii g/0. 2mL/只，背部皮下分点注射。采用细胞融合技术无菌取脾脏制备脾细胞，在聚乙二醇-1500作用下与NStl骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备CLOPmAb ；多抗制备用CL0P-2C-BSA载体蛋白结合抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为50 y g 100 y g/次，背部皮下分多点注射；首免，用合成的人工抗原与等量弗氏完全佐剂乳化；加强免疫，用合成的人工抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫4 5次，每次间隔4 8周，最后一次免疫后10 15天，以ELISA法测其定效价达到IO5以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，_20°C冻存备用。本专利技术的胶体金层析检测试纸条和试纸卡具有下列各项优点①特异性强，敏感性高。该胶体金层析检测试纸条和试纸卡以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体(mAb)或多克隆抗体(pAb)为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对单克隆抗体或多克隆抗体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，试纸条和试纸卡具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量可达到Ippb lOppb。②简便、快速、时效性强。使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，只要将试纸条插入被检样品或将待检样品滴加在试纸卡上10 20秒钟，在10分钟内即可判定检测结果。③结果显示形象、直观、准确。胶体金层析检测试纸条和试纸卡均以显示棕红色线“ I ”和“ I I ”作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条棕红色线“ I ”时，表示在被检样品中含有被检物，显示两条棕红色线“ I I ”时，表示在被检样品中不含被检物。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。④节省费用，适用范围广，便于推广。使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，比用仪器分析和进口 ELISA试剂盒的费用大幅下降。另外，试纸条和试纸卡的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验，海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。附图说明图1、氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条结构示意图。图2、氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条俯视结构示意图。图3、为本专利技术的氯羟吡啶半抗原改造的技术路线图。图4、为氯羟吡啶的红外质谱图。图5、为氯羟吡啶改造后的半抗原红外质谱图。具体实施例方式一种适用于氯羟吡啶残留检测的胶体金层析检测试纸条和试纸卡，它包括检测试纸条或试纸卡、用于检测的试剂，其中试剂包括样品稀释液，样品提取液。要制成氯羟吡啶 胶体金层析检测试纸条和试纸卡，首先需要对氯羟吡啶半抗原进行改造，制备氯羟吡啶偶联载体蛋白，用于制备相应的检测线和抗体；而且需要制备氯羟吡啶金标抗体，用于制备相应的金标抗体纤维棉。本专利技术还包括动物可食性组织如肝脏、肌肉、饲料样品预处理方法，将待检动物组织或饲料样研磨捣碎后经乙腈完全提取，烘干后加入适量样品稀释液即可用于本胶体金层析检测试纸条和试纸卡检测；尿样无需研磨捣碎直接按一定比例添加乙腈和稀释液进行检测。本专利技术的胶体金层析检测试纸条和试纸卡，样品处理简单，适合于大量样品的快速检测和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡，包括衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、玻璃吸水垫，其特征在于：所述金标结合垫为吸附有胶体金标记的抗氯羟吡啶单克隆抗体或多克隆抗体玻璃纤维棉，在所述硝酸纤维素膜上有用氯羟吡啶?载体蛋白偶联物印制的隐形检测线，用山羊抗小鼠IgG印制的隐形对照线。

【技术特征摘要】
1.一种氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡，包括衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、玻璃吸水垫，其特征在于所述金标结合垫为吸附有胶体金标记的抗氯羟吡啶单克隆抗体或多克隆抗体玻璃纤维棉，在所述硝酸纤维素膜上有用氯羟吡啶-载体蛋白偶联物印制的隐形检测线，用山羊抗小鼠IgG印制的隐形对照线。2.根据权利要求1所述的氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡，其特征在于，所述的隐形检测线和隐形对照线平行排列组合为“ 11 ”。3.根据权利要求1所述的试纸条或卡，其特征在于，所述金标物结合垫为将1: 100 1: 500稀释(体积比)的胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉中，4°C低温真空干燥，制备CLOP金标物结合垫。4.根据权利要求3所述的试纸条或卡，其特征在于，所述胶体金标记抗体制备方法为将稀释后的胶体金和单克隆抗体或多克隆抗体按照不同的浓度倍比，选择胶体金显色红色的最小稀释浓度作为胶体金标记抗体的最佳量，用于胶体金标记抗体的制备。5.根据权利要求4所述的试纸条或卡，其特征在于，所述单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法为 Al、氯羟吡啶半抗原的改造亲核取代反应引入酯键，然后在碱、酸的作用下，合成含有羧基的氯羟吡啶半抗原； A2、CL0P-2C-载体蛋白人工抗原的合成采用活泼酯法合成CLOP人工免疫原，称取75mg CLOP半抗原溶解于3mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入二环己基碳二亚胺35mg和N-轻基琥珀酰亚胺1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海棠，范国英，王自良，姜金庆，王淑云，杨雪峰，丁涵，李艺，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：