淡紫醌霉素及其甲酯的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种淡紫醌霉素及其甲酯的制备方法。以链黑菌素产生菌-柔毛链霉菌Streptomyces.flocculus?CGMCC4.1223作为出发菌株，对该链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶基因stnBl实行选择性敲除，获得相应的stnBl基因失活突变株ΔstnBl；对突变株发酵产物粗提物采用反相硅胶、凝胶等柱层析和半制备HPLC等色谱分析技术，制得淡紫醌霉素及其甲酯。本发明专利技术建立了利用链黑菌素产生菌通过基因工程手段制备淡紫醌霉素的方法，提高了淡紫醌霉素和淡紫醌霉素甲酯的产量，分别达到每5升培养基可以获得约1mg淡紫醌霉素和20mg淡紫醌霉素甲酯，并且经过菌种优化和发酵优化还有进一步提升的空间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗肿瘤试剂制备领域，尤其涉及一种抗肿瘤试剂淡紫醌霉素Iavendamycin及其甲酯的生产工程菌株构建方法及它们的制备方法。
技术介绍
链黑菌素是一个由绒毛链霉菌(Streptomyces flocculus)产生的具有独特喹啉环结构的抗肿瘤抗生素。其抗肿瘤活性良好，是一种广谱抗肿瘤抗生素，对脑癌、颈癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌，特别是对白血病、淋巴瘤和黑素瘤具有很好的疗效。链黑菌素的药理作用是可选择性地抑DNA合成，主要作用于S期，一个分子的链黑菌素可与2000个分子的脱氧核苷酸稳定地结合，并能使瘤细胞染色体断裂，使已形成的DNA降解.由于具有较大的骨 髓毒性，因此很少单独用药用于临床。链黑菌素含有四个环，其中三个环几乎处于同一个平面，而第四个环与这个平面几乎呈垂直状态。淡紫醌霉素(Iavendamycin)是从链霉菌(S.1avendulea strain C22030)分离鉴定的氨基醌类化合物，具有与链黑菌素相类似的结构，但是其化学结构含有五个环，这五个环几乎处于同一平面。淡紫醌霉素具有与链黑菌素相近的抗肿瘤活性和抗肿瘤谱，但是比链黑菌素低得多的毒性。自1981年淡紫醌霉素被报道以来，仅仅只有一例关于其产生菌的报道，目前该产生菌被国外公司保存，且产量低，文献报道在8升发酵培养基中仅获得O. 3mg淡紫醌霉素。而淡紫醌霉素甲酯则是淡紫醌霉素利用化学合成手段通过与甲醇发生酯化反应获得的抗生素，目前并没有天然微生物产生淡紫醌霉素甲酯的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供利用链黑菌素产生菌通过生物技术操作制备淡紫醌霉素Iavendamycin及其甲酯的方法。链黑菌素产生菌Streptomyces flocculusCGMCC4. 1223的菌种来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，寄存来源是上海医药工业研究院。参考文献中国科学院微生物研究所放线菌分类组，《链霉菌鉴定手册》，1975，P202-205，科学出版社，北京。本专利技术通过对柔毛链霉菌Streptomyces flocculus CGMCC4. 1223进行针对链黑菌素生物合成基因簇中双氧化酶的选择性失活突变，得到相应的双氧化酶失活突变菌株，从该突变株的发酵液中分离到淡紫醌霉素(Iavendamycin)及其甲酯化合物。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的第一方面，本专利技术涉及一种淡紫醌霉素的制备方法，包括如下步骤A、以链黑菌素原始产生菌柔毛链霉菌Streptomyces flocculus CGMCC4. 1223为出发菌株，克隆得到链黑菌素生物合成基因簇；B、对所述链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶StnBl基因进行选择性失活，获得StnBl基因失活突变菌株Λ stnBl ；C、对所述突变菌株Λ stnBl进行发酵，将发酵液离心，离心后的滤液调整pH值至9 10，用不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取，取水相滤液；D、调整所述水相滤液pH值至4 5，用所述不溶于水的中等极性有机溶剂反复萃取，收集中等极性有机溶剂相B，浓缩得到粗提物B，对所述粗提物B进行纯化，即得。该淡紫醌霉素，其结构式如式(I )所示权利要求1.一种淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 A、以链黑菌素原始产生菌柔毛链霉菌Str印tomycesflocculus CGMCC4. 1223为出发菌株，克隆得到链黑菌素生物合成基因簇； B、对所述链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶StnBl基因进行选择性失活，获得StnBl基因失活突变菌株AstnBl ； C、对所述突变菌株AstnBl进行发酵，将发酵液离心，离心后的滤液调整pH值至9 10，用不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取，取水相滤液； D、调整所述水相滤液pH值至4 5，用所述不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取，收集中等极性有机溶剂相B，浓缩得到粗提物B，对所述粗提物B进行纯化，即得。2.如权利要求1所述的淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，所述不溶于水的中等极性有机溶剂A为乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。3.如权利要求1所述的淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，步骤C中，所述不溶于水的中等极性有机溶剂A与离心后的滤液的体积比为1:3 2:1。4.如权利要求1所述的淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，步骤D中，所述不溶于水的中等极性有机溶剂A与水相滤液的体积比为1:3 2:1。5.如权利要求1所述的淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，步骤D中，所述纯化为用PH值为11 13的碱性水溶液溶解所述粗提物B并离心，收集上清液；向上清液中滴加盐酸至出现沉淀；离心弃去上清，沉淀冻干后加入乙腈溶解，经半制备性PHLC，以乙腈水溶液洗脱，接收对应的吸收峰，合并馏分后放置_20°C以下，待有沉淀析出后低温离心，弃去上清，冻干沉淀，即得所述淡紫醌霉素。6.如权利要求5所述的淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，所述乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为20% 100%。7.如权利要求5所述的淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，所述碱性水溶液为O.1 IM NaOH 溶液。8.一种淡紫醌霉素甲酯的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 A、以链黑菌素原始产生菌柔毛链霉菌Str印tomycesflocculus CGMCC4. 1223为出发菌株，克隆得到链黑菌素生物合成基因簇； B、对所述链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶StnBl基因进行选择性失活，获得StnBl基因失活突变菌株AstnBl ； C、对所述突变菌株AstnBl进行发酵，将发酵液离心，离心后的滤液调整pH值至9 10，用不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取，保留中等极性有机溶剂相A，浓缩得到粗提物A，对所述粗提物A进行纯化，即得。9.如权利要求8所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法，其特征在于，步骤C中，所述不溶于水的中等极性有机溶剂A为乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。10.如权利要求8所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法，其特征在于，步骤C中，所述不溶于水的中等极性有机溶剂A与离心后的滤液的体积比为1:3 2:1。11.如权利要求8所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法，其特征在于，步骤C中，所述纯化为将粗提物A用正相硅胶柱层析，以石油醚和中等极性有机溶剂B的混合物作为流动相洗脱，经HPLC分析检测，合并含有淡紫醌霉素甲酯的馏分并浓缩，然后用反相硅胶进行柱层析，用甲醇水溶液洗脱，将所得到的馏分经HPLC检测后合并馏分，浓缩干燥，得淡紫醌霉素甲酯。12.如权利要求11所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法，其特征在于，所述作为流动相的石油醚和中等极性有机溶剂B的体积比为1:3 10:1。13.如权利要求11或12所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法，其特征在于，所述中等极性有机溶剂B为乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、丙酮或异丙醇。14.如权利要求11所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法，其特征在于，所述甲醇水溶液中甲醇的体积浓度为60% 100%。全文摘要本专利技术公开了一种。以链黑菌素产生菌-柔毛链霉菌Streptomyces.flocculus CGMCC4.1223作为出发菌株，对该链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶基因stnBl实行选择性敲除，获得相应的stnBl基因失活突变株ΔstnBl；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：A、以链黑菌素原始产生菌柔毛链霉菌Streptomyces?flocculus?CGMCC4.1223为出发菌株，克隆得到链黑菌素生物合成基因簇；B、对所述链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶stnBl基因进行选择性失活，获得stnBl基因失活突变菌株ΔstnBl；C、对所述突变菌株ΔstnBl进行发酵，将发酵液离心，离心后的滤液调整pH值至9～10，用不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取，取水相滤液；D、调整所述水相滤液pH值至4～5，用所述不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取，收集中等极性有机溶剂相B，浓缩得到粗提物B，对所述粗提物B进行纯化，即得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林双君，邓子新，徐飞，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：