一种弧菌交叉保护性抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种弧菌交叉保护性抗原及其制备方法和应用，该抗原为弧菌重组的麦芽糖孔蛋白LamB，本发明专利技术的制备方法能够大量的表达具有天然免疫活性的重组麦芽糖孔蛋白LamB，易于纯化，且成本低。本发明专利技术的LamB蛋白作为外膜主要蛋白在各种弧菌中广泛存在，序列具有很好的保守性，其本身作为抗原，在以斑马鱼为免疫模型中，对多种弧菌具有交叉保护性，其兔抗血清对多种弧菌具有交叉反应性和被动免疫保护作用，因此本发明专利技术的重组麦芽糖孔蛋白LamB可以作为弧菌的交叉保护性抗原应用到水产养殖中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程及免疫学领域，具体地说，涉及一种弧菌交叉保护性抗原及其制备方法和应用。
技术介绍
弧菌属(Vibrio)广泛分布于自然界，尤以水中为多，有100多种。主要致病菌可引起霍乱或食物中毒。弧菌的外膜蛋白在其致病过程起着非常重要的作用，是一种良好的免疫原；孔蛋白作为主要的外膜蛋白之一，是弧菌交叉保护性疫苗的热门研究对象也是弧菌高效免疫原的热门研究对象。一些孔蛋白如0mpK、0mpU和OmpV，其基因序列在弧菌中具有很好的保守性，作为抗原时，具有良好的免疫原性和免疫保护性，而OmpK更是被证明具有良好的交叉保护性。麦芽糖孔蛋白(maltoporin),是一个与麦芽糖、麦芽糊精的运输相关的孔蛋白。根据其噬菌体的受体特性命名为LamB。LamB蛋白质的生理功能和蛋白结构研究比较成熟，但是其免疫学性质研究较少，未见到有LamB蛋白作为抗原的相关报道。评价弧菌LamB基因序列的保守性，免疫原性和交叉免疫保护作用，将有助于探讨开发弧菌麦芽糖孔蛋白LamB 作为交叉保护性抗原的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种弧菌交叉保护性抗原及其制备方法和应用。为了实现本专利技术的目的，本专利技术将弧菌的麦芽糖孔蛋白编码基因LamB经过基因克隆、原核表达和产物制备，得到重组的麦芽糖孔蛋白LamB，该重组蛋白可以作为弧菌的交叉保护性抗原应用到水产养殖中。本专利技术的目的是提供一种麦芽糖孔蛋白编码基因LamB，该基因具有如SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 或SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。本专利技术根据已有的LamB序列，设计简并引物获得了溶藻弧菌ATCC33787 (Vibrio algin。Iyticus)、副溶血弧菌ATCCl7802(Vibrio parahaem。lyticus)、副溶血弧菌VPL4-90 (Vibrio parahaemolyticusVPL4_90)、拟态弧菌ATCC33653(Vibrio mimicus)、非01 霍乱弧菌(Vibrio cholerae VbO)、河弧菌ATCC33810(Vibrio fluvialis)、弗尼斯弧菌ATCC33813 (Vibrio furnissii)和哈维氏弧菌 NBRC15634 (Vibrio harveyi)的基因 LamB。简并引物序列如下LamB-F:5，-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，LamB-R:5’-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3’其中，S=C/G；N=A/C/G/T ；Y=C/T ；R=A/G ；其中，溶藻弧菌ATCC33787的基因LamB的核苷酸序列如SEQID NO. I所示，副溶血弧菌ATCC17802的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，副溶血弧菌VPL4-90的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，拟态弧菌ATCC33653的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，非01霍乱弧菌的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，河弧菌ATCC33810的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，弗尼斯弧菌ATCC33813的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，哈维氏弧菌NBRC15634的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示。溶藻弧菌ATCC33787、副溶血弧菌ATCC17802、拟态弧菌ATCC33653、河弧菌 ATCC33810、弗尼斯弧菌ATCC33813和哈维氏弧菌NBRC15634六株弧菌为标准菌株，保藏于美国模式培养物集存库ATCC和日本技术评价研究所生物资源中心NBRC。副溶血弧菌 VPL4-90和非01霍乱弧菌购买于广东环凯微生物科技有限公司。本专利技术的目的是提供一种麦芽糖孔蛋白LamB，该蛋白是由上述麦芽糖孔蛋白编码基因编码的。本专利技术的目的是提供一种来源于溶藻弧菌ATCC33787的麦芽糖孔蛋白编码基因 LamB编码的LamB蛋白，该麦芽糖孔蛋白具有如SEQ ID NO. 9所示的氨基酸序列。本专利技术的目的是提供一种重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备方法，该方法包括如下步骤(I)麦芽糖孔蛋白编码基因LamB的克隆；(2)大肠杆菌表达载体pET32_LamB的构建；(3)大肠杆菌重组菌BL21-pET32_LamB的构建；(4)重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备。具体的，本专利技术提供的一种重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备方法，该方法包括如下步骤(I)麦芽糖孔蛋白编码基因LamB的克隆设计简并引物，以弧菌的基因组DNA为模板，进行PCR，得到麦芽糖孔蛋白编码基因LamB ;然后将其连至pMD19_T中，构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-LamB ;将该载体转化至DH5 α感受态细胞，构建大肠杆菌重组菌 DH5 a -pMD19-T-LamB，测序；其中简并引物序列如下LamB-F:5’-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，LamB-R:5’-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3’其中，S=C/G；N=A/C/G/T ；Y=C/T ；R=A/G ；(2)大肠杆菌表达载体pET32_LamB的构建设计表达引物，以克隆载体 pMD19-T-LamB为模板，进行PCR，将得到的LamB基因与表达载体pET32a(+)用BamH I和 Xho I进行双酶切，连接，构建大肠杆菌表达载体pET32-LamB ;其中表达引物序列如下LamBeF:5’-CGCGGATCCGCAGTGGATTTTAAC-3’LamBeR:5’-CCGCTCGAGATTCGGCTTTTACCAC-3’ ；(3)大肠杆菌重组菌BL21-pET32_LamB的构建将(2)中的大肠杆菌表达载体 pET32-LamB转化BL21感受态细胞，得到大肠杆菌重组菌BL21-pET32_LamB ；(4)重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备在液体LB (含100 μ g/ml的氨苄青霉素)培养基中按1%比例接入培养过夜的(3)中的大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB菌液，在37°C 培养至0D600=0. 6后加入ImM异丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)，于37°C温度进行诱导表达6h ;收集菌体，纯化包涵体，包涵体纯化液直接过镍NTA琼脂糖凝胶FF柱，亲和层析纯化重组酶，咪唑梯度竞争洗脱，得到纯化的重组麦芽糖孔蛋白LamB。本专利技术的目的是提供一种由上述方法制备的重组麦芽糖孔蛋白LamB，所述重组麦芽糖孔蛋白LamB可以作为弧菌的交叉保护性抗原应用到水产养殖中。本专利技术的目的是提供制备重组麦芽糖孔蛋白LamB的简并引物LamB-F:5’-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，LamB-R:5’-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3’ ；其中，S=C/G；N=A/C/G/T ；Y=C/T ;R=A/G。本专利技术的目的是提供制备重组麦芽糖孔蛋白LamB的表达引物LamBeF:5’-C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种麦芽糖孔蛋白编码基因LamB，其特征在于，该基因具有如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.6、SEQ?ID?NO.7或SEQ?ID?NO.8所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种麦芽糖孔蛋白编码基因LamB，其特征在于，该基因具有如SEQ ID NO. USEQ IDNO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。2.一种重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备方法，该方法包括如下步骤 (1)麦芽糖孔蛋白编码基因LamB的克隆； (2)大肠杆菌表达载体pET32-LamB的构建； (3)大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB的构建； (4)重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 (O麦芽糖孔蛋白编码基因LamB的克隆设计简并引物，以弧菌的基因组DNA为模板，进行PCR，得到麦芽糖孔蛋白编码基因LamB ;然后将其连至pMD19_T中，构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-LamB ;将该载体转化至DH5 α感受态细胞，构建大肠杆菌重组菌DH5 a -pMD19-T-LamB，测序；其中简并引物序列如下LamB-F:5，-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，LamB-R:5’-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3’其中，S=C/G ；N=A/C/G/T ；Y=C/T ；R=A/G ； (2)大肠杆菌表达载体pET32-LamB的构建设计表达引物，以克隆载体pMD19-T_LamB为模板，进行PCR，将得到的LamB基因与表达载体pET32a(+)用BamH I和Xho I进行双酶切，连接，构建大肠杆菌表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡忠，夏常艳，伦镜盛，袁传飞，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：