本发明专利技术属于动物传染病亚单位疫苗制备技术领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌保护性抗原的制备及应用。本发明专利技术克隆了一种副猪嗜血杆菌外膜蛋白Hbp?B基因，其核苷酸序列如SEQID?NO：1所示，该基因编码的序列如SEQ?ID?NO：2所示。构建了一种重组大肠杆菌(Escherichia?coli)?BL21/pET-28a-Hbp?B(保藏号为CCTCC?NO：M2011228)，它包含序列表SEQID?NO：1所述的基因。申请人还得到一种副猪嗜血杆菌的抗原蛋白：它是由SEQ?ID?NO：1所述的基因转化大肠杆菌所表达的。本发明专利技术还公开了该重组大肠杆菌的制备方法与应用。本发明专利技术制备的副猪嗜血杆菌亚单位疫苗具有良好的安全性，其免疫保护效果达到83％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物传染病亚单位疫苗制备
，具体涉及一种副猪嗜血杆菌保护性抗原制备及应用。针对副猪嗜血杆菌病的防制，本专利技术设计了编码一种保护性抗原蛋白基因Hbp B的克隆表达、功能验证和疫苗应用研究。所述基因表达的抗原蛋白能够提高猪抵抗副猪嗜血杆菌病的能力。
技术介绍
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)可引起猪的格拉泽氏病(Glasser’sdisease)，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征。目前根据琼脂扩散血清分型方法可将副猪嗜血杆菌分为15个标准血清型(Kieletein等，1992)，另外约20%以上的临床分离株无法定型。其中毒力较强的血清型为血清4型、5型和13型，我国猪群分离到的主要血清型是4型、5型、13型(蔡旭旺等，2005)。该菌是猪上呼吸道常在菌，在特定条件下侵入机体而引起严重的全身性疾病。近年来由于饲养技术的调整不当以及经常突发新的呼吸道综合症，使得副猪嗜血杆菌病日趋流行危害日渐严重，对全球范围内的养猪业造成巨大的危害。副猪嗜血杆菌病影响2周龄到4月龄猪群，主要在断奶前后和保育阶段发病，发病率一般在10 % -15 %，严重时死亡率可达到50 %。目前研究已发现HPS可与猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒及圆环病毒等引起混合感染或继发感染，使病情复杂化。2006年6月以来，“无名高热病”在我国南方和中部几个省市大面积流行，给生猪养殖业造成了巨大的经济损失，有研究表明副猪嗜血杆菌是重要的继发感染或混合感染的病原之一，加重了高热病的症状，增加死亡率。目前国外已高度重视对副猪嗜血杆菌病的研究，美国、西班牙、澳大利亚、丹麦等国均对本国的副猪嗜血杆菌病进行了流行病学调查。我国对该病的认识较少，近年来才引起高度重视。由于缺乏足够的流行病学资料，致病机理不清，尚无有效的通用商品苗和敏感的诊断方法，该病在许多国家一直未能得到有效地控制。由HPS引起的副猪嗜血杆菌病近几年来的流行趋势呈上升状态，当前的主要防制手段是药物控制和疫苗接种。近年来猪群对抗菌药物的依赖性不断提高，氨苄西林、头孢菌素、壮观霉素及氟喹诺酮类等可用于预防和治疗副猪嗜血杆菌病的药物已经引起大量耐药菌株的出现。抗生素的长期、广泛和不合理使用势必会导致耐药菌株的不断增多、耐药谱日益扩大以及严重的药物残留，对食品安全和人类健康造成严重威胁。尽管当前对副猪嗜血杆菌的致病机理尚处研究阶段，但现今针对该病的疫苗研究仍取得了一定进展。商用灭活苗和自家苗可以在一定程度上控制副猪嗜血杆菌的感染，然而血清型多样性以及占很大比例的不能分型菌株影响了商品苗的防制效果，因此常常在大规模免疫时失败。自家苗的保护可能更有针对性，但也有很多失败的例子，主要是因为分离到的副猪嗜血杆菌不是真正的致病菌株或不是主要致病血清型。亚单位疫苗同时具有活疫苗的免疫效力高、交叉保护力强以及灭活苗的安全性好等优点，具有良好的应用前景。鉴于此，本专利技术着手于副猪嗜血杆菌一种新型免疫保护性抗原的研究，鉴定免疫保护效果好，并且在15种副猪嗜血杆菌标准血清型中广泛存在的免疫原性外膜蛋白，进而制备成有效的副猪嗜血杆菌亚单位疫苗。本专利技术制备的副猪嗜血杆菌亚单位疫苗具有良好的安全性，免疫保护效果达到83%以上。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，其第一个目的是获得一株能够分泌副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原蛋白的重组大肠杆菌，利用该重组大肠杆菌获得免疫原性良好的保护性外膜蛋白。本专利技术的第二个目的是利用上述外膜蛋白制备副猪嗜血杆菌亚单位疫苗。本专利技术通过以下技术方案实现 申请人通过基因克隆方法，从副猪嗜血杆菌SH0165菌株中分离克隆得到一种外膜蛋白Hbp B基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，序列长度为1695bp，该基因的编码序列如序列表SEQ ID NO :2所示，其编码564个氨基酸。将所述的Hbp B基因片段转化大肠杆菌，获得一种包含副猪嗜血杆菌SH0165菌株外膜蛋白Hbp B基因并能表达该基因的重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/PET28a_Hbp B。为了实现本专利技术的目的，申请人获得一株能够分泌副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的重组大肠杆菌(Escherichia coli) BL21/pET-28a_Hbp B,该菌株已于2011年6月30日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO M 2011228.在本专利技术的实施例中，申请人提供了这种副猪嗜血杆菌新型免疫保护性抗原HbpB的详细制备方法，并描述了该保护性抗原蛋白可能的应用前景。更详细的技术方案如《具体实施方式》所述。附图说明图I :是本专利技术的基本研究路线。图2 :是本专利技术的重组质粒pET-28a(+)_Hbp B双酶切鉴定图(泳道I)及其超螺旋重组质粒图谱(泳道2)。图3 :是本专利技术重组抗原蛋白Hbp B纯化后SDS-PAGE(A)及Western Blot(B)图。图4 :是本专利技术重组抗原基因Hbp B在副猪嗜血杆菌15个标准血清型的表达通用性试验结果(泳道1-15依次表示为HPS 1-15血清型标准菌株)。图5 :是本专利技术重组抗原蛋白Hbp B免疫小鼠后所诱导的试验组和对照组的抗体水平检测。图6 :是本专利技术重组抗原蛋白Hbp B免疫小鼠后的攻毒(5LD5Q)保护力效果。图7 :是本专利技术所用的载体质粒pET_28a(+)的图谱。具体实施例方式实施例I :副猪嗜血杆菌重组抗原蛋白Hbp B的克隆及表达一材料I质粒与菌株本专利技术采用的pET_28a(+)质粒购自德国Novagen公司，该pET_28a(+)质粒图谱如图7所示。感受态细胞大肠杆菌DH5a和BL 21 (DE 3)为北京全式金生物技术有限公司女口广叩ο本专利技术所用副猪嗜血杆菌菌株为HPS SH0165菌株为华中农业大学农业微生物国家重点实验室筛选(参见蔡旭旺，副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究，2006年6月，华中农业大学博士论文，中国国家图书馆，中国国家数字图书馆http://res4.nlc.gov.cn/home/search.trs method = showDetail&channelid = 3&id =003448570)，副猪嗜血杆菌15个标准血清型菌株由澳大利亚Blackall PJ博士惠赠。 2副猪嗜血杆菌抗原基因Hbp B (如下所述)基因来源HbpB( > gi I 219870279 :2142475-2144169, Haemophilus parasuisSHO165 chromosome, complete genome)本专利技术使用的抗原基因序列的登录号及其在副猪嗜血杆菌SH0165菌株中所处的位置(括号内显示为有下划线的为所述的抗原基因HbP B在Genebank中的登录号，其后的分号后的数字为该登录号所示基因序列在副猪嗜血杆菌SH0165菌株基因组中的位置，该位置后显示的加粗斜体字为所述的副猪嗜血杆菌的菌株号。3主要试剂及缓冲液氯化钠、碳酸钠、甘油、乙醇、乙酸等是上海国药集团化学试剂有限公司产品；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离克隆的外膜蛋白Hbp？B基因，它的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金梅林，周明光，赵建平，张强，张安定，康超，徐高原，
申请(专利权)人：华中农业大学，武汉科前动物生物制品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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