猪副嗜血杆菌血清4型、5型、13型三价油乳剂灭活疫苗制造技术

技术编号:4305238 阅读:344 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
猪副嗜血杆菌血清4型、5型、13型三价灭活油乳剂疫苗。它是应用我国猪副嗜血杆菌三个主要的流行血清型的分离株作为抗原,通过用TSB肉汤培养扩繁24h后,经过0.3%甲醛灭活11-13h,三个血清型的抗原以1∶1∶1的比例混合,然后加入与抗原总体积相等的油相,再经乳化制备而成。用于预防由当前流行的猪副嗜血杆菌主要血清型菌株引起的猪的以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种猪副嗜血杆菌三价油乳剂灭活的制备方法及其在预防由猪副嗜血杆菌引起的各种病症中的应用。2.
技术介绍
猪副嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪Glasser' s病的病原体,猪上呼吸道的一种共栖菌,它可以在特定条件下侵入机体而引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的全身性疾病。猪副嗜血杆菌是一种非溶血性,非运动性、NAD依赖型、革兰氏阴性细小杆菌。随着世界养猪业的发展,该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。 在猪群的养殖中,做好平时的预防工作尤为重要。猪副嗜血杆菌是一种内继发性疾病,存在多种传播方式,导致猪副嗜血杆菌定居于仔猪体内的时间不同,定居时间取决与母猪免疫情况、母猪带菌水平、仔猪母源抗体水平等。有研究表明,对母猪接种猪副嗜血杆菌细菌灭活苗,母猪免疫后产下的仔猪要比未免疫过母猪生下的仔猪出现肺炎和关节炎的几率要小,而且相对症状较轻,增重也要高于后者,从而说明了母源抗体对仔猪有良好的保护作用。但是,随着日龄的增大,断奶仔猪母源抗体逐渐衰减以至不能有效预防带菌仔猪感染无猪副嗜血杆菌感染定居的仔猪,所以设法减少带菌仔猪的比例是控制猪副嗜血杆菌对生产造成影响的有效方法,对仔猪通过有效疫苗的免疫就显得至关重要。Solano(1998)通过对仔猪进行疫苗接种表明可以使仔猪的免疫保护时间更长。大量研究证实了免疫商品疫苗成功的案例,目前使用的疫苗主要是灭活的单价及二价灭活疫苗,通过接种这些疫苗可以有效控制该疫病的发生。但是,由于猪副嗜血杆菌本身血清型较多,商品疫苗是否具有较好的交叉保护就成为很现实的问题,所以,研制一种多价血清型且含有独特菌株的商品疫苗是非常关键的。3.
技术实现思路
现有的猪副嗜血杆菌灭活苗多为单价及二价灭活苗,分别针对血清4型、血清5型及血清13型。本专利技术提供一种三价的灭活疫苗,同时预防当前我国猪副嗜血杆菌流行菌株的主要血清型即血清4型、5型和13型引起的疾病。 4.技术方案本专利技术的技术方案是,将猪副嗜血杆菌血清4、5、13型分离株分别进行培养,灭活后加入吐温-80制成油乳剂的水相;利用马可52轻质石蜡油及司本_80、硬脂酸铝制成油相。将水相和油相等体积混合后乳化,从而得到猪副嗜血杆菌三价灭活疫苗。其具体制备方法如下 1)细菌的培养将猪副嗜血杆菌血清4型、5型和13型三株种子菌分别接种于TSA固体培养基,37t:恒温箱中培养,24h后挑取单个菌落,接入含NAD及小牛血清的TSB液体培养基中,37°C 、 180r/min条件下振荡培养12_16h后再将此菌液按1 %的比例加入新配制的TSB液体培养基中进行大量增殖。37°C、180r/min振荡培养24h后,收集菌液,用分光光度3计测定细菌总菌含量。 2)细菌的灭活按TSB液体培养基总体积加入0. 3%甲醛灭活,于37。C振荡灭活11-13h。 3)油乳剂水相的制备三个血清型的菌种灭活后,将各个血清型的菌液浓度均调至lX10,FU/ml,按1 : 1 : 1的体积比混合,按总体积4%加入灭菌吐温_80,边加边搅拌。 4)油相制备取马可52轻质石蜡油93份,加入硬脂酸铝1份并搅拌直到透明为止,随后加入6份司本-SO,充分混匀,12rC高压蒸汽灭菌30min,冷却至室温备用。 5)油乳剂灭活苗的制备将制备好的油相和水相等体积混合,边加边搅拌,至完全溶解,并于均质机中进行乳化。 本三价油乳剂灭活苗的保存条件为2 8°C。 本专利技术的优点是可以预防由猪副嗜血杆菌血清4、5、13型菌株引起的疾病,对于同血清型菌株的免疫保护达到85%。相对于目前的商品疫苗来讲,可以单针免疫较多的血清型,使用方便,并提高了对其他血清型交叉保护的可能性。具体实施例方式结合实施对本专利技术做进一步描述和论证。 实施例1 已制备好的猪副嗜血杆菌血清4型、5型、13型三价油乳剂灭活疫苗,昆明种小鼠70只,灭菌生理盐水,规格为lml注射器,疫苗菌株。 实验步骤 1、70只小鼠分为注射疫苗组30只,攻毒组30只,空白对照组10只。 2、疫苗组小鼠每只颈部皮下注射疫苗0.2ml,空白对照组注射等量灭菌生理盐水。 3、全部小鼠均置于相同条件下饲养,14d后,进行攻毒保护试验。 4、先将每个疫苗菌株扩繁11-13h,然后将浓度均调至2Xl(^CFU/ml。做攻毒保护试验时,将注射疫苗组小鼠分为3组,每组10只,分别腹腔注射SWUN0662、 SWUN0661、SWUN0642菌株菌液,每只小鼠注射菌液lml。攻毒组也分为三组,每组10只,攻毒组的攻毒方式同疫苗注射组。攻毒后,注意观察小鼠的临床症状,并记录死亡时间和死亡率。 实验结果攻毒对照组在24h内,死亡率均在70%以上,而疫苗免疫组的攻毒保护率均在80%左右。 实施例2 已制备好的猪副嗜血杆菌三价灭活苗,昆明小白鼠20只,灭菌生理盐水,lml注射器实验步骤 1、将小鼠分为两组,一组为注射疫苗组,另一组为注射生理盐水的空白对照组。 2、注射疫苗组的小鼠每只注射疫苗0.2ml,对照组注射等量生理盐水。所有小鼠均置于相同条件下饲养。 3、注射后28d内观察小鼠的精神及采食等情况。 实验结果28d内,小鼠没有出现精神萎靡,采食量降低等不良状况。表明该疫苗对于小鼠具有较高的安全性。权利要求猪副嗜血杆菌血清4型、5型、13型三价油乳剂灭活疫苗,其特征是由我国当前猪副嗜血杆菌主要流行血清型4、5、13型的分离株经灭活后按比例混合制成三价油乳剂灭活疫苗。所含佐剂的成份有矿物油、表面活性剂。2. 根据权利要求1所述的三价油乳剂灭活疫苗所用的分离株为猪副嗜血杆菌血清4、 5、 13型,菌株编号为SWUN0662、SWUN0661、SWUN0642,均分离自广东。3. 根据权利要求1所述的三价油乳剂灭活疫苗,其中所述抗原的制备方法为,将猪副 嗜血杆菌血清4、5、13型分离株接种于1%的0. 02% NAD溶液及5%新生小牛血清的TSB肉 汤,37°C 、 180r/min振荡培养24h,加入终浓度为0. 3%的甲醛灭活1 l_13h,最后将三种菌株 的培养物浓度均浓縮至1 X 101QCFU/ml 。4. 根据权利要求1所述的三价油乳剂灭活疫苗,其中所述矿物油为马可52轻质石蜡油。5. 根据权利要求1所述的三价油乳剂灭活疫苗,其中所述表面活性剂为司本-80、吐 温-80、硬脂酸铝。6. 根据权利要求1所述的三价油乳剂灭活疫苗,其中所述的油乳剂灭活苗的制备方 法,该方法包括以下步骤1) 细菌的培养将猪副嗜血杆菌血清4型、5型和13型三株种子菌分别接种于TSA固 体培养基,37t:恒温箱中培养,24h后挑取单个菌落,接入含NAD及小牛血清的TSB液体培 养基中,37t:、180r/min条件下振荡培养12_16h后再将此菌液按1%的比例加入新配制的 TSB液体培养基中进行大量增殖。37°C 、 180r/min振荡培养24h后,收集菌液,用分光光度 计测定细菌浓度。2) 细菌的灭活按TSB液体培养基总体积0.3X缓慢加入甲醛,于37t:振荡灭活 11-13h。3) 油乳剂水相的制备三个血清型的菌种灭活后,将各个血清型的菌液浓度均调至lxi(TcFU/mi,然后将调整浓度后的菌液按i :本文档来自技高网
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【技术保护点】
猪副嗜血杆菌血清4型、5型、13型三价油乳剂灭活疫苗,其特征是由我国当前猪副嗜血杆菌主要流行血清型4、5、13型的分离株经灭活后按比例混合制成三价油乳剂灭活疫苗。所含佐剂的成份有矿物油、表面活性剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:岳华汤承罗添添
申请(专利权)人:西南民族大学
类型:发明
国别省市:90[中国|成都]

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