一种EHEC O157：H7重组嗜酸乳杆菌载体疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种EHEC O157:H7嗜酸乳杆菌载体疫苗及其制备方法和应用，所述重组嗜酸乳杆菌为转化入含EHEC O157:H7EspA‑Tir M双表位保护性抗原的活载体菌，本发明专利技术构建的重组嗜酸乳杆菌株在有无选择压力下均能稳定地体外传代，通过口服疫苗免疫小鼠，并进行攻毒实验，证明该嗜酸乳杆菌活载体疫苗具有良好的免疫原性和免疫保护效果，该活载体疫苗安全无毒、免疫预防效果良好。

【技术实现步骤摘要】
一种EHECO157：H7重组嗜酸乳杆菌载体疫苗及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程
，涉及一种活载体疫苗的开发，具体涉及一种制备EHECO157:H7双价重组嗜酸乳杆菌载体疫苗的方法和应用。
技术介绍
肠出血性大肠埃希菌(enterohaemorrhagicE.coli,EHEC)O157:H7主要通过消化道传播，临床可引起出血性肠炎、溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等，甚至可导致死亡。自1983年Riley等首次确认EHECO157:H7引起的严重出血性结肠炎以来，EHECO157:H7引起的散发病例和暴发流行在世界范围内不断发生，全球发病呈上升趋势。目前对EHECO157:H7感染尚缺乏有效的防治措施，尽管大部分抗生素可将其杀灭，但释放出来的志贺毒素会增加并发溶血性尿毒综合症的危险。鉴于EHECO157:H7暴发流行的严重性和抗生素治疗的危险性，安全有效的疫苗是预防其感染的首选，但目前尚无可用于人的疫苗，因此疫苗的研发尤为重要。EHECO157:H7的致病性主要体现于细菌在宿主体内的黏附定植和产生毒素两个方面。黏附与定植是细菌感染的第一步，Tir和EspA在细菌黏附和形成特征性的黏附和抹平损伤(attachingandeffacinglesion,A/Elesion)，即A/E损伤的效应分子传递中起到重要的桥梁作用，若阻断O157:H7细菌感染的黏附起始阶段则可以避免和擦拭性损伤的发生，从而终止感染。其中黏附素Intimin、紧密黏附素受体Tir和Ⅲ型分泌系统T3SS相关蛋白是EHECO157:H7重要的毒力因子，有研究表明人体在感染EHECO157:H7后对Tir、Intimin、EspA、EspB有强烈的免疫应答，提示这些蛋白可作为潜在的疫苗候选抗原。因此，我们选择EHECO157:H7Tir和EspA两个关键性定植功能蛋白作为研制预防其感染的疫苗候选抗原，构建具有保护性的新型O157:H7Tir和EspA双价抗原的疫苗。近年来，乳酸菌表达系统广泛用于表达外源目的基因，是黏膜免疫抗原和药物传递载体的理想选择，在食品、医学和兽医学上具有良好的应用前景。乳酸菌作为载体表达和传递抗原可黏附定植于黏膜上皮细胞，可提高某些免疫活性因子如IL-2、TNF-α、INF的分泌，诱发强烈的黏膜免疫应答，并且安全无毒、不被胆汁破坏，在体内可组成型高效表达和分泌外源蛋白，所研制的活菌制剂可以直接应用，免去了一般基因工程菌所需的烦琐、复杂的提取工艺。但迄今为止，国内外未见嗜酸乳杆菌表达EHECO157:H7抗原的研究报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种EHECO157:H7重组嗜酸乳杆菌活载体疫苗的制备方法本专利技术是通过以下技术方案来实现：(1)通过重叠延伸PCR法制备EspA-TirM双链融合基因；(2)将EspA-TirM双链融合基因插入双酶切后的pMG36e载体中，得到重组质粒(pMG36e-EspA-TirM)；(3)将重组质粒(pMG36e-EspA-TirM)电转化入嗜酸乳杆菌，构建重组嗜酸乳杆菌(ATCC4356/pMG36e-EspA-TirM)，并鉴定；(4)检测步骤(3)得到的重组嗜酸乳杆菌中EspA-TirM蛋白表达及免疫原性，获得EHECO157:H7的重组嗜酸乳杆菌候选疫苗株；(5)在有、无选择压力的情况下进行体外传代培养，鉴定重组嗜酸乳杆菌疫苗株的稳定性。上述制备方法，其特征在于：步骤(2)中对重组双链EspA-TirM序列和pMG36e载体分别经PstI和HindIII双酶切，用T4连接酶进行连接；步骤(3)中所述嗜酸乳杆菌为ATCC4356。上述技术方案中所述的重组嗜酸乳杆菌即用于预防EHECO157:H7感染的活载体疫苗。所述EspA-TirM双链融合基因序列如SEQIDNo.1所示:atggatacatcaaatgcaacatccgttgttaatgtgagtgcgagttcttcgacatcgacgatctatgacttaggtaatatgtcgaaggatgaggtggttaagctatttgaggaactcggtgtttttcaggctgcgattctcatgttttcttatatgtatcaggcacaaagtaatctgtcgattgcaaagtttgctgatatgaatgaggcatctaaagcgtcaaccacggcacaaaagatggctaatcttgtggatgccaaaattgctgatgttcagagtagcactgataagaatgcgaaagccaaacttcctcaagacgtgattgactatataaacgatccacgtaatgacataagtgtaactggtattcgtgatcttagtggtgatttaagcgctggtgatctgcaaacagtgaaggcggctatttcagctaaagcgaataacctgacaacggtagtgaataatagccagctcgaaattcagcaaatgtcgaatacattaaatctcttaacgagtgcacgttctgatgtgcaatctctacaatatagaactatttcagcaatatcccttggtaaaggaggcggaagtggaggaggtagcagcccaaccacgaccgaccctgatgcagctgcaagtgcaactgaaactgcgacaagagatcagttaacgaaagaagcgttccagaacccagataatcaaaaagttaatatcgatgagctcggaaatgcgattccgtcaggggtattgaaagatgatgttgttgcgaatatagaagagcaggctaaagcagcaggcgaagaggccaaacagcaagcSEQIDNo.1。本专利技术的一个方面提供了一种用作肠出血性大肠埃希菌EHECO157:H7疫苗的重组嗜酸乳杆菌，其特征在于：所述重组嗜酸乳杆菌为转化入外源载体的嗜酸乳杆菌，所述外源载体为含EspA-TirM蛋白编码序列的载体。进一步地，所述含EspA-TirM蛋白编码序列的载体为pMG36e-EspA-TirM载体。进一步地，所述pMG36e-EspA-TirM载体由pMG36e载体和EspA-TirM融合基因连接组成。进一步地，所述EspA-TirM融合基因由EHECO157:H7的保护性抗原EspA和TirM融合而成，其序列为SEQIDNo.1。本专利技术的另一个方面提供了一种预防EHECO157:H7的疫苗，所述疫苗包括活性成分和药学上可接受的载体，其特征在于：所述活性成分为前述重组嗜酸乳杆菌。本专利技术的再一个方面提供了一种制备上述重组嗜酸乳杆菌的制备方法，包括下述步骤：(1)通过重叠延伸PCR法制备EspA-TirM双链融合基因；(2)将EspA-TirM双链融合基因插入双酶切后的pMG36e载体中，得到连接产物；(3)将连接产物电转化嗜酸乳杆菌，鉴定含有pMG36e-EspA-TirM重组子嗜酸乳杆菌；(4)检测步骤(3)得到的重组嗜酸乳杆菌中EspA-TirM蛋白表达及免疫原性，获得EHECO157:H7疫苗的重组嗜酸乳杆菌；(5)在有和/或无选择压力的情本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用作肠出血性大肠埃希菌EHEC O157:H7疫苗的重组嗜酸乳杆菌，其特征在于：所述重组嗜酸乳杆菌为转化入外源载体的嗜酸乳杆菌，所述外源载体为含EspA‑Tir M蛋白编码序列的载体。

【技术特征摘要】
1.一种用作肠出血性大肠埃希菌EHECO157:H7疫苗的重组嗜酸乳杆菌，其特征在于：所述重组嗜酸乳杆菌为转化入外源载体的嗜酸乳杆菌，所述外源载体为含EspA-TirM蛋白编码序列的载体；所述含EspA-TirM蛋白编码序列的载体为pMG36e-EspA-TirM载体；所述pMG36e-EspA-TirM载体由pMG36e载体和EspA-TirM融合基因连接组成；所述EspA-TirM融合基因由EHECO157:H7的保护性抗原EspA和TirM融合而成，其序列为SEQIDNo.1。2.一种预防EHECO157:H7的疫苗，所述疫苗包括活性成分和药学上可接受的载体，其特征在于：所述活性成分为权利要求1所述的重组嗜酸乳杆菌。3.一种制备如权利要求1所述的重组嗜酸乳杆菌的制备方法，包括下述步骤：(1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：范宏英，林如琴，吴娴波，龙北国，张益多，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44