一种蓝色天然染料的合成方法及提取工艺，属于生物工程领域。本发明专利技术的目的是采用生物材料合成无毒环保蓝色天然染料的合成方法及提取工艺。本发明专利技术以纯化的褐色产色链霉菌基因组DNA作为模板，使用引物C1:5'-aaTTAATTAAGGAGGAGCCCATatgagcgtagagaccatccc-3'和引物C2：5'-aaGCTAGCAAGCTTtcagtagttgggcgtcttgc-3'通过聚合酶链式反应扩增indigoidine合成酶基因SC-indC，扩增得到的SC-indC基因序列为：SEQ ID NO：1。本发明专利技术的利用工程菌合成蓝色天然染料indigoidine的方法及其提取工艺染料产率高，不受原料来源限制，操作过程易控制，生产成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域。
技术介绍
近些年来，随着科技的进步及人们生活水平的提高，染料的应用越来越广泛，尤其对无毒环保型染料的需求越来越大，这对染料工业的发展提出了更高的要求。目前的染料按其来源，主要可以分为两大类天然染料及合成染料。天然染料应用较早，且大多无毒环保，但存在着在自然界中含量有限、提取工艺复杂、生产成本高等局限性。合成染料与天然染料相比具有色泽鲜艳、不受原料来源限制、生产成本低等优点，但缺点在于合成染料大多结构复杂，生物毒性高，在自然界中很难降解或降解成本很高，对生态环境破坏较大。天然染料与合成染料的上述缺点严重制约了染料工业的迅速发展及其应用领域的进一步拓展。·
技术实现思路
本专利技术的目的是采用生物材料合成无毒环保蓝色天然染料的合成方法及提取工艺。本专利技术以纯化的褐色产色链霉菌基因组DNA作为模板，使用引物Cl: 5’_aaTTAATTAAGGAGGAGCCCATatgagcgtagagaccatccc-3，和引物 C2 :5，-aaGCTAGCAAGCTTtcagtagttgggcgtcttgc-3’通过聚合酶链式反应扩增indigoidine合成酶基因SC-indC,貧增得到的SC-indC 基因序列为SEQ ID NO : I。本专利技术上述基因翻译后得到的indigoidine合成酶,命名为SC-indC,其序列为SEQ ID N0:2。本专利技术以纯化的褐色产色链霉菌基因组DNA作为模板，使用引物BI: 5’-aaGGATCCatgttcgacctggacggaac-3，和引物 B2 :5，-aaGAATTCtcagtcgaccgggggctgct-3，通过聚合酶链式反应扩增indigoidine合成调控基因5T-i/7o0，扩增得到的SC-indB基因序列为SEQ ID N0:3。本专利技术上述调控基因翻译后得到的indigoidine合成调控蛋白，命名为SC_indB,其序列为SEQ ID NO :4。本专利技术扩增得到的SC-indC基因通过限制性核酸内切酶NdeI和HindIII连接到pET28a (+)质粒载体中，即得重组质粒pET28a (+) /SC-indC ;构建得到的重组质粒pET28a(+)/5T-i/ i/C转化进入工程菌BL21 (DE3)中，命名转化后的工程菌为C。本专利技术扩增得到的5^-41基因通过限制性核酸内切酶NdeI和HindIII连接到pET28a (+)质粒载体中，即得重组质粒pET28a (+) /SC-indC ；扩增得到的SC-indB基因通过限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI连接到pACY⑶uet_l质粒载体中，即得重组质粒pACYCDuet-l/5T-i/ o ;构建得到的重组质粒 pET28a (+) /SC-incm pACYCDuet-l/5T-i/ o 共转化进入工程菌BL21 (DE3)中，命名转化后的工程菌为CB。本专利技术合成蓝色天然染料的方法，a、工程菌C的种子培养液； b、制作indigoidine标准曲线； C、工程菌C发酵液中indigoidine的提取； d、工程菌C发酵液中indigoidine的合成。本专利技术合成蓝色天然染料的方法， a、工程菌CB的种子培养液； b、制作indigoidine标准曲线； C、工程菌CB发酵液中indigoidine的提取； d、工程菌CB发酵液中indigoidine的合成。本专利技术采用SC-indC合成蓝色天然染料的方法， a、从保存有工程菌C的固体培养基上挑取单个菌落于5mL含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37 °C，300rpm摇床中培养12小时，即得工程菌C的种子培养液；所述固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为胰蛋白胨1%;酵母提取物O.5% ；NaCl 1% ;琼脂2% ；pH 7. O ;灭菌后添加卡那霉素50ug/mL ;所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为胰蛋白胨1%;酵母提取物O. 5%;NaCl 1%;pH 7. O ； b、吸取ImL上述中得到的工程菌C的种子培养液加入到IL含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37°C，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为胰蛋白胨1%;酵母提取物O. 5%;NaCl 1% ；pH 7. O ;用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到O. 4时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于25°C的摇床之中连续培养5个小时；取200mL上述发酵液于离心机中850Xg离心5分钟去除工程菌C的细胞；将去除细胞后的发酵液于21000Xg离心10分钟得到粗提物；将粗提物用ImL甲醇振荡悬浮，然后21000 Xg离心10分钟，弃上清，此过程重复2次用于去除粗提物中的有机物；之后采用同样的方法用乙酸乙酯和正己烷分别清洗2次上述粗提物，从而得到纯净的化合物，经液相色谱及质谱鉴定此纯净化合物为indigoidine ;将提纯后的indigoidine在天平上称重，每Img所得提纯的indigoidine中加入ImL DMSO超声溶解,使indigoidine的最终浓度为lmg/mL ;将此 lmg/mL 的 indigoidine 标准溶液用 DMSO 分别稀释得到 0. 01mg/mL、0. 05 mg/mL、0. I mg/mL、0. 15 mg/mL、0. 20 mg/mL、0. 25mg/mL的6种不同浓度的标准溶液；用分光光度计于600nm波长下分别检测上述6种不同浓度标准溶液的吸光度；以indigoidine的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标线性拟合得到indigoidine的标准曲线； C、取ImL工程菌C的发酵液于离心管中21000Xg离心10分钟，去除发酵液上清得到蓝色沉淀；将蓝色沉淀用ImL甲醇振荡悬浮，然后21000 Xg离心10分钟，弃上清，此过程重复3次，用于去除沉淀中的其它有机物，得到indigoidine的粗提物；将上述粗提物用ImLDMSO超声溶解并于离心机中850 X g离心5分钟去掉不溶于DMSO的物质,得到纯净indigoidine的蓝色DMSO溶液；取ImL上述蓝色DMSO溶液于比色皿中，用分光光度计于600nm波长下检测其吸光度；根据标准曲线计算得到ImL发酵液中indigoidine的产量,进而计算得到IL发酵液中indigoidine的总产量； d、吸取ImL工程菌C的种子培养液加入到IL含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37°C,300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为胰蛋白胨1%;酵母提取物O. 5%;NaCl 1% ；pH 7. O ;用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到O. 4 I. O时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于18°C 25°C的摇床之中连续培养I 56个小时；每隔I小时吸取ImL工程菌C的发酵液进行indigoidine的提取。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种合成蓝色天然染料的基因，其特征在于：以纯化的褐色产色链霉菌基因组DNA作为模板，使用引物C1:?5“?aaTTAATTAAGGAGGAGCCCATatgagcgtagagaccatccc?3“和引物C2：5“?aaGCTAGCAAGCTTtcagtagttgggcgtcttgc?3“通过聚合酶链式反应扩增indigoidine合成酶基因SC?indC，扩增得到的SC?indC基因序列为：SEQ ID NO：1。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：乔楠，陶福平，于大禹，徐富超，
申请(专利权)人：东北电力大学，
类型：发明
国别省市：
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