用于评估试验化合物对基于细胞的系统中的LRRK2的作用的方法，所述方法包括步骤a）评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物中对LRRK2的Ser910和/或Ser935的磷酸化状态的作用；和/或b）评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物中对LRRK2与14-3-3多肽结合的作用。该方法可包括或进一步包括评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物中对LRRK2的亚细胞定位的作用的步骤。认为该方法可用于评估公认的基于细胞的系统中的LRRK2抑制剂，包括体内系统中的LRRK2抑制剂。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于确定LRRK2抑制剂的试验本专利技术涉及用于评估LRRK2抑制剂的试验。编码富亮氨酸重复序列蛋白激酶_2 (LRRK2)的基因中的常染色体显性错义突变使人类易于患帕金森氏病。LRRK2突变的患者通常患有帕金森氏病，其临床表现和症状不易区分于60-70岁左右的自发性帕金森氏病。LRRK2突变占家族性帕金森氏病的 4%，并在1%的散发性帕金森氏病患者中观察到LRRK2突变。LRRK2是一种较大的酶(2527个残基)，其由富亮氨酸重复序列(残基1010-1287)、 GTP酶结构域(残基1335-1504)、C0R结构域(残基1517-1843)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域(残基1875-2132)和WD40重复序列(残基2231-2276)构成。已报导了超过40种错义突变。在之前的工作中，已使用各种类型的重组LRRK2对LRRK2的突变型亚群的活性以及定位进行分析，所述的各种类型的重组LRRK2使用多种方法表达和测定。 最常见的突变包括位于激酶结构域的亚结构域VII-DFG基序的高度保守的Gly2019进行氨基酸取代成Ser残基，使LRRK2的蛋白激酶活性提高约2倍。该发现表明LRRK2 的抑制剂可用于治疗帕金森氏病。也报导了在分散的细胞溶质池中蓄积的各种突变体如 LRRK2和LRRK2 ，认为其由错误折叠的蛋白聚集体构成。在采用肽底物如LRRKtide或Nictide的试验中，可容易地在体外测定 LRRK2固有的蛋白激酶催化活性；这还参见WO 2008/122789和PCT/GB2009/002047。这使得有可能进行筛选以确定抑制剂。最近的工作表明广泛分布的称为H-1152的Rho-激酶 (ROCK)抑制剂也以相似的效价抑制LRRK2 (IC5tl为150nM) 。用于治疗肾细胞癌和其它癌症的多靶点酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼(商品名索坦，也称为SU11248)最近被证实可抑制LRRK2 (IC50为20nM)。我们还发现H-1152和舒尼替尼对LRRK2 突变体的抑制比野生型LRRK2强两到四倍。根据LRRK2激酶结构域的分子模拟，我们设计了耐药性LRRK2突变体，其具有正常活性，但对H-1152的敏感度降低32倍，对舒尼替尼的敏感度降低12倍。由于对于LRRK2是如何被调节的以及其底物是什么了解甚少，因此开发LRRK2抑制剂的瓶颈是如何评估这些化合物在体内的相对有效性。我们提供了可用于在基于细胞的系统中评估的LRRK2抑制剂的方法。我们证明了 LRRK2激酶活性调节邻近富亮氨酸重复序列结构域的两个N-端残基(Ser910和Ser935)的磷酸化，所述的磷酸化介导与磷适体 14-3-3蛋白的结合。与此一致的是，H-1152和舒尼替尼诱导Ser910和Ser935的去磷酸化，从而破坏14-3-3与野生型LRRK2和LRRK2 的相互作用，但未破坏其与耐药性LRRK2突变体的相互作用。我们提供的证据表明破坏14_3_3的结合诱导LRRK2在胞质池中蓄积，这表现为与之前报导的LRRK2和LRRK2突变体的胞质池相似。Ser910和Ser935的磷酸化或14_3_3结合，或LRRK2的亚细胞定位，可用于监测LRRK2抑制剂的效果。本专利技术的第一个方面提供了用于评估试验化合物在基于细胞的系统中对LRRK2 的作用的方法，所述方法包括步骤a)评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物对LRRK2的Ser910和/或Ser935的磷酸化状态的作用；和/或b)评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物对LRRK2与14_3_3多肽结合的作用。在某些实施方案中，该方法可包括或进一步包括评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物中对LRRK2的亚细胞定位的作用的步骤。所述方法可进一步包括选择认为对基于细胞的系统中的LRRK2具有抑制作用的化合物的步骤，其中如果LRRK2的Ser910和/或Ser935的磷酸化在暴露后降低；和/或 LRRK2与14-3-3多肽的结合在暴露后降低，则选择该试验化合物。所述的试验化合物一般地可以是选作可能的LRRK2抑制剂的化合物，例如通过体外试验选择的，所述的体外实验例如使用LRRKtide或Nictide作为LRRK2底物多肽的试验。适合将化合物选作LRRK2的可能抑制剂的试验的实例描述于例如WO 2008/122789和 PCT/GB2009/002047 中。一般地，Ser910的磷酸化是使用特异性结合于Ser910磷酸化的LRRK2的抗体或特异性结合于Ser910未磷酸化的LRRK2的抗体来评估的。一般地，Ser935的磷酸化是使用特异性结合于Ser935磷酸化的LRRK2的抗体或特异性结合于Ser935未磷酸化的L RRK2的抗体来评估的。特异性结合于Ser910磷酸化的LRRK2的抗体是指与Ser910磷酸化的LRRK2结合， 而不与Ser910未磷酸化的LRRK2或其它磷酸化的丝氨酸残基结合的抗体结合。类似地，特异性结合于Ser935磷酸化的LRRK2的抗体不与Ser935未磷酸化的LRRK2或其它磷酸化的丝氨酸残基结合。广泛结合于磷酸化的丝氨酸残基的抗体不是特异性结合于Ser910磷酸化的LRRK2的抗体或特异性结合于Ser935磷酸化的LRRK2的抗体。类似的考虑也适用于特异性结合于Ser910未磷酸化的LRRK2的抗体或特异性结合于Ser935未磷酸化的LRRK2的抗体。特异性结合于Ser910未磷酸化的LRRK2的抗体不与Ser910磷酸化的LRRK2结合。特异性结合于Ser935未磷酸化的LRRK2的抗体不与 Ser935磷酸化的LRRK2结合。产生和使用这种抗体的方法对于本领域技术人员是显而易见的。在实施例中描述了这种抗体和生成及使用它们的方法的实例。所述的抗体可为多克隆或单克隆的。例如，如本领域技术人员所熟知，ELISA类型的试验可以是特别有用的。可通过用于评估蛋白蛋白相互作用的任何合适适用的技术来评估LRRK2与 14-3-3多肽的结合。如以下进一步讨论的，一般地可以通常使用FRET (荧光共振能量转移)技术。其它可能有用的技术可利用免疫沉淀技术。例如，对于本领域技术人员是显而易见的，免疫沉淀可使用特异性结合于LRRK2的抗体进行免疫沉淀；或可使用特异性结合于 14-3-3多肽的抗体进行，其对于本领域技术人员是显而易见的。本领域技术人员熟知特异性结合于14-3-3多肽的抗体对于本领域技术人员是熟知的，并且从商业上可得到该抗体有市售。另外，对于本领域技术人员是显而易见的是，免疫沉淀可使用与重组LRRK2上存在的标记特异性结合的抗体来进行免疫沉淀；或使用与重组14-3-3多肽上存在的标记特异性结合的抗体进行，其对于本领域技术人员是显而易见的。例如，认为可使用Invitrogen的Alpha-Elisa技术将磷酸/去磷酸-LRRK检测和 14-3-3共拉下(co-pull down)或抗LRRK2抗体(非磷酸化状态依赖性)进行结合，这可用于实现高通量筛选系统。也可使用利用基于电化学发光的Luminex珠或板检测(MSD ；meso scale discovery)的多重检测。可应用于蛋白蛋白和磷酸蛋白检测的Alpha scr本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·阿莱西，R·J·尼克尔斯，N·泽姆科，
申请(专利权)人：医学研究理事会，
类型：
国别省市：
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