铜绿假单胞菌血清分型检测方法和试剂盒以及用于该方法和试剂盒的寡核苷酸序列技术

本发明专利技术涉及检测铜绿假单胞菌的方法、试剂盒和寡核苷酸。本发明专利技术以种特异性和血清型特异性的方式，快速、灵敏并可靠地检测铜绿假单胞菌。特别是，本发明专利技术提供了血清型特异性检测铜绿假单胞菌的方法、铜绿假单胞菌血清型特异性检测试剂盒，以及所述方法和试剂盒中所用的寡核苷酸。本发明专利技术还涉及铜绿假单胞菌血清型特异性抗体在用本发明专利技术的方法或试剂盒确定为特定铜绿假单胞菌血清型的铜绿假单胞菌感染的患者的血清性特异性治疗中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及检测铜绿假单胞菌血清型特异性的方法，铜绿假单胞菌血清型特异性的试剂盒，以及在上述方法或试剂盒中所用的寡核苷酸。本专利技术进一步涉及用于患有由特定的铜绿假单胞菌血清型导致的疾病的患者的铜绿假单胞菌感染的血清型特异性治疗的铜绿假单胞菌血清型特异性抗体。专利技术背景铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种在水和土壤中发现的普遍存在的革兰氏阴性环境细菌。它是一种典型的机会致病菌，通常不会对免疫活性宿主构成威胁， 免疫活性宿主通过调节抗体和吞噬作用清除它。然而，囊胞性纤维症患者和免 疫功能低下的个体-包括烧伤患者、在重症监护病房的气管插管的患者，癌症和艾滋病患者以及接受器官移植的病人，感染医源性感染如感染铜绿假单胞菌的风险特别高。这些患者中严重的感染能迅速致命，由铜绿假单胞菌感染造成的“呼吸机相关性肺炎”的死亡率达33-50%。更重要的是，铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性显著提高。例如，抗第三代头孢菌素头孢他啶的铜绿假单胞菌菌株的比例已经从1995年的12%增加到2001年的29%。再加上耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)，铜绿假单胞菌在医源性感染中占 34%，该感染已经从1975年7. 2 / 1000患者日感染量增加到9. 8 / 1000患者日感染量。 其中最常见的医源性感染形式为血流感染和肺炎。在抗生素耐药性增加的背景下，用于被动免疫以抗铜绿假单胞菌感染的人类单克隆抗体的运用是一个新的可期待的途径。已经证明，针对革兰氏阴性细菌表面的主要成分-O-抗原特异性碳水化合物的抗体在特异的防止由铜绿假单胞菌引起感染中，是重要的介质。由于O-抗原外部碳水化合物层具有不同的血清型，因此需要有多种血清型特异性抗体，以提供广泛的防止铜绿假单胞菌感染的保护。目前有很多用于区分不同铜绿假单胞菌血清型的方案。通常可接受的国际抗原分型方案(IATS)是基于O-抗原特异性脂多糖(LPS)相关碳水化合物的血清学特性。目前至少已经描述了 20种不同的O-抗原血清型。已经证明大多数医源性铜绿假单胞菌感染与特定血清型相关。虽然不同国家之间血清型发病率不同，但流行病学调查表明，血清型 IATS-01, IATS-06, IATS-Oll 和血清组 2 (IATS-02，IATS-05, IATS-016)是最常见的，占铜绿假单胞菌临床分离株的70%。为了采用O-抗原特异的以及类似的血清型特异性抗体治疗铜绿假单胞菌感染的患者，一个基本的要求是在抗体治疗之前确定感染的铜绿假单胞菌菌株的血清型。为了检测铜绿假单胞菌感染，诊断培养被认为是黄金标准。但是，用传统的细菌培养方法检测假单胞菌需要长达2天时间。不幸的是，培养后的菌落的形状，大小和形态都不能进行血清型识别。血清学方法对于清楚的血清型识别存在较高的错误率。例如，玻片凝聚血清型测定方法不仅耗时，所得的结果在很大程度上依赖于操作者的经验和表述，并且还受到自凝聚或非凝聚铜绿假单胞菌菌株的限制。市场上最可靠的血清分型试剂盒存在约30%的失败率，这些铜绿假单胞菌株由于自凝聚或非凝聚而被归为“不可分类”菌株。这种标准的微生物分析方法在合理的时间范围内可靠识别铜绿假单胞菌以及相关血清型的能力很有限。假如一个患者遭受了由耐抗生素型铜绿假单胞菌引起的感染，用于血清型鉴定的时间非常关键，因为随着持续感染，死亡率会急剧上升。因此，医疗中迫切需要有快速的血清型鉴定方法，以减少诊断与血清型特异性抗体治疗之间的时间。目前，通过生物芯片、微阵列或PCR技术的分子检测已经成为快速鉴定铜绿假单胞菌以及其他导致医源性感染的细菌种类的常规方法。在这些方法的步骤中采用了包含独一无二的、种特异性的标记序列的基因。迄今为止，许多PCR方法通过采用能与例如16S rRNA或23S rRNA的部分区域特异性退火的寡核苷酸序列来靶定系统发育基因和功能基因。然而，采用这些种特异性分析进行特定血清型鉴定是不可能的。US20080026370公开了寡核苷酸探针，其用于在一个生物芯片或微阵列上杂交分析铜绿假单胞菌的致病型和基因型，但未公开血清型分型方法。W09741234公开了属于铜绿假单胞菌的LPS O-抗原基因簇的不同基因的特性。提供的是一个通过PCR检测样品中的血清型01至020的方法，包括采用一个能够扩增包括编码PsbM(WbpM),或PsbN(WbpN)的核苷酸序列的核苷酸分子的探针来处理样品。未公开用于可靠区分不同铜绿假单胞菌血清型的特异性寡核苷酸序列。因此，现有技术中所知的用于鉴定特定铜绿假单胞菌血清型的方法具有严重的缺占-^ \\\ ·铜绿假单胞菌的微生物分析方法耗时而且受自凝聚或非凝聚铜绿假单胞菌菌株的限制。已知的用于常规细菌菌株基因型或血清型分析的分子方法不能在细菌种内进行可靠的鉴定和区分。尽管一些基因例如核糖体基因(16S rDNA, 23S rDNA)，在不同种之间具有同源性，但是利用代表这些基因的保守寡核苷酸序列进行一个细菌种内的这些血清型分型和鉴定也是不可能的。因此，急需快速可靠的专用于细菌种类以及最常见的铜绿假单胞菌血清型的铜绿假单胞菌血清型检测方法。为了区分细菌定殖(彡103_6cfu/ml)和感染(>106cfu/ml)，需要在至少六个数量级的范围内确定铜绿假单胞菌的细菌含量。因此，还需要在一个宽的模板浓度范围内能进行可靠的铜绿假单胞菌的检测分析。在单个反应中同时进行几种铜绿假单胞菌血清型(尤其是 IATS-01, IATS-06, IATS-Oll和血清组2)的检测在技术上难度很高，由于每种血清型检测的引物对和探针对之间会相互影响，经常导致不能达到临床所需的检测精度。令人惊喜的是，根据本专利技术已经发现的寡核苷酸，并利用该寡核苷酸的方法和试剂盒，采用血清型特异性引物能够可靠快速地进行铜绿假单胞菌的种及血清型鉴定。
技术实现思路
因此，本专利技术的技术问题是提供一种快速的、准确的、灵敏的和可靠的特异性检测临床上最常见的铜绿假单胞菌血清型的方法。该技术问题通过提供以下寡核苷酸，以及采用如下定义的寡核苷酸的检测方法和试剂盒来解决根据本专利技术，提供一种用于样本 铜绿假单胞菌血清型特异性检测的方法，包括如下步骤a)使至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性引物与样本的一个靶标核苷酸退火，其中所述至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性引物选自由以下构成的组(i)含有SEQ ID No. I所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No. 2所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，(ii)含有SEQ ID No. 3所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No. 4所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，(iii)含有SEQ ID No. 5所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No. 6所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，以及(iv)含有SEQ ID No. 7所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No. 8所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，b)扩增靶标核苷酸，并且c)检测扩增的所述假单胞菌的靶核苷酸。本文中所用的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.02.26 EP 10002022.11.检测样本中铜绿假单胞菌血清型特异性的方法，包括以下步骤 a)退火至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性引物到样本的靶标核苷酸上，其中所述至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性引物选自以下构成的组 (i)含有SEQ ID No. I所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ IDNo. 2所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物， ( )含有SEQ ID No. 3所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ IDNo. 4所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物， (iii)含有SEQID No. 5所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ IDNo. 6所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，以及 (iv)含有SEQID No. 7所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ IDNo. 8所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物， b)扩增靶标核苷酸，并且 c)检测扩增的所述假单胞菌的靶核苷酸。2.根据权利要求I所述的方法，其中检测步骤包括将至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性杂交探针与选自权利要求I所述的至少一对退火的铜绿假单胞菌血清型特异性引物的序列杂交的步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性杂交探针选自以下构成的组 (i)第一寡核苷酸探针包括SEQ ID No. 9所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No. 10所示序列中至少10个连续核苷酸， ( )第一寡核苷酸探针包括SEQ ID No. 11所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No. 12所示序列中至少10个连续核苷酸， (iii)第一寡核苷酸探针包括SEQID No. 13所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No. 14所示序列中至少10个连续核苷酸，以及 (iv)第一寡核苷酸探针包括SEQID No. 15所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No. 16所示序列中至少10个连续核苷酸，4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述铜绿假单胞菌血清型特异性杂交探针被检测标签所标记。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述检测标签选自以下构成的组发光标记物、荧光标记物、放射性标记物和酶标记物。6.根据权利要求2至5任一所述的方法，其中铜绿假单胞菌血清型检测通过定量分析、扩增曲线检测或熔解曲线分析的方法进行。7.根据权利要求I 6任一所述的方法，可同时检测两种或更多种铜绿假单胞菌血清型。8.根据权利要求7所述的方法，其中所检测的血清型指铜绿假单胞菌血清型IATS-01、IATS-06、IATS-Oll和血清组2，其中血清组2包括血清型IATS-02、IATS-05和IATS-016。9.根据权利要求I 8任一所述的方法，其中所述样本选自以下构成的组体液如唾液、支气管肺泡灌洗液、气管内吸入物、血液、尿、组织和从细菌培养物中分离的DNA。10.根据权利要求I 8任一所述的方法，其中所述样本选自食物、土壤和水。11.根据权利要求I 10任一所述的方法，其中所述样本可被检测的细菌含量在10cfu/ml 109cfu/ml 的范围内。12.根据权利要求I 11任一所述的方法，其中所述方法是种特异性的。13.一对寡核苷酸，选自以下构成的组 a.含有SEQID No. I所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQID No. 2所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物， b.含有SEQID No. 3所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQID No. 4所示序列中至少10...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·艾默里奇，米歇尔·鲁道夫，霍尔格·科赫，
申请(专利权)人：肯塔生物技术股份公司，
类型：
国别省市：