本发明专利技术涉及酶电化学生物传感器检测水体环境中酚类化合物的方法。所述生物传感器检测装置包括工作电极、辅助电极、参比电极、检测池和电化学工作站；具体操作步骤：将亲水性离子液体(例如，1-丁基-3-甲基咪唑丙氨酸，BMIM[Ala])加入介孔碳溶液中，振荡半小时，得到新型的介孔碳和亲水性离子液体的复合材料；将酪氨酸酶加入到介孔碳和亲水性离子液体的复合材料溶液中，振荡一小时，滴加到工作电极表面得到固载酪氨酸酶的工作电极；将固载酪氨酸酶的工作电极、辅助电极和参比电极插入到盛有磷酸缓冲液的检测池中，在搅拌的条件下加入酚类化合物的单一标准品，即产生了相应的电流响应信号。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物传感领域，特别是涉及新型氨基酸离子液体改性的介孔碳复合材料固载酪氨酸酶的电化学传感器检测水体环境中酚类化合物的方法。
技术介绍
酚类化合物是环境中广泛存在的一类有机污染物，主要来自炼焦、医药、化工等工业排放及农药降解。饮用水源中的酚类化合物在加氯消毒的水处理工艺中可生成毒性更大、具有“三致”效应的氯酚等，从而威胁饮用水安全。随着人们对水体环境安全及身体健康的日益关注，迫切需要快速判断地表水及饮用水源的安全状况。酚类化合物作为水体环境中的一类重要有机污染物，对人类和动植物有潜在的危害。为了预防酚类污染物的危害，发展用于环境(特别是饮用水、地表水和废水)中酚类污染物快速、灵敏、可靠、可重复使用的检测方法显得尤为重要。目前对环境中酚类污染物的筛查检测通常利用色谱和光谱等方法完成。然而这些仪器通常集中在某些远离现场的实验室，不仅仪器价格昂贵，而且通常需要专业的操作人员和复杂的样品预处理以及萃取步骤，很难满足水环境中酚类快速现场检测的要求。本专利技术所使用的酶电化学传感器结合了酶和电化学的优点，总体来说，包括以下几个方面的优势1)、选择性好，酶分子对底物选择专一性强，具有非常高的特异性识别能力；2)、电化学响应快，灵敏度高；3)、成本低廉，可重复使用；4)、设备便携容易微型化，适合大批量样品的现场检测。酪氨酸酶是一种具有生物催化活性的蛋白质，在生物体外容易失去活性，因此目前许多酪氨酸酶传感器普遍存在一个问题是操作和存储稳定性不够高。本专利技术使用对酶分子生物相容性较好的固定基底(氨基酸离子液体改性的介孔碳复合材料)来提供一个有利的微环境以保持其生物活性和稳定性。介孔碳复合材料改善了单纯的介孔碳材料水相分散性差的问题，提高了实验操作的重现性。介孔碳材料的空间限制效应，能够防止酶分子的去折叠失活，提高了酶的长期稳定性和生物催化活性。同时氨基酸离子液体具有很好的生物相容性，为固载的酪氨酸酶分子提供了更加友好的微环境； 酶分子与导电基底之间由于距离较近而减少了长程电子运输，利于电化学换能，提高传感器的灵敏度；介孔碳多孔的网络骨架结构还可以为酶反应的底物和产物提供转移的通道， 提高传感器的响应速度。此外，本专利技术使用的氨基酸离子液体对含苯环(通过η电子)和羟基(通过氢键)的酚类污染物具有较强的相互作用，可以通过富集效应进一步提高检测的灵敏度。本专利技术提供了一种简易、快速而灵敏的水体环境中酚类化合物的检测方法，不仅提高了酪氨酸酶的存储稳定性，还具有更高的灵敏度和更低的检测限。仪器设备选择性好， 小型廉价，检测通量大，样品不需要前处理，适合水体样品的现场快速检测。酪氨酸酶传感器直接应用于水体环境样品的现场快速检测，达到经济、灵敏、准确和大批量检测的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于三电极系统的酶电化学生物传感器及应用其检测水体环境中酚类化合物的方法，是能够用于现场筛查检测环境污染物、尤其是水体中酚类化合物的生物传感器检测方法。本专利技术要解决的技术问题是提高酪氨酸酶电化学传感器的长期稳定性，并且提供一种应用于水体中酚类污染物筛查的基于酪氨酸酶电化学传感器的检测方法，应用其对酚类污染物检测。此检测方法应具有灵敏度高，检测限低，长期稳定性好，步骤简单，结果准确可靠，适合大批量样品现场检测的特点。酪氨酸酶传感器检测酚类污染物的原理酪氨酸酶能够利用分子氧催化单酚(或多酚)生成相应的邻苯酚和邻苯醌，而邻苯醌又可以在电极表面通过电化学催化还原生成相应的邻苯酚形成信号循环放大。通过记录酪氨酸电化学传感器与酚类污染物作用前后的电信号变化可以判断目标分析物是否存在及其总量。对于单一的目标分析物，该酶基传感器的信号变化强度与目标分析物的浓度在一定范围内线性相关。对于水、土壤、食品、空气、 烟道气等复杂的目标样品，该酶基传感器能够快速筛查目标样品中是否含有酚类化合物。本专利技术将酪氨酸酶分子诱陷到IOnm孔径的亲水介孔碳复合材料的介孔中。在液相中，亲水性的室温离子液体(BMM[Ala])与疏水性介孔碳材料混匀振荡半小时得到表面亲水改性的介孔碳离子液体复合材料。亲水性离子液体(BMIM[Ala)在液相中对介孔碳表面进行可控的 亲水改性，使离子液体在介孔碳表面形成近“单层”或多层的修饰，解决了介孔碳在水相中分散性差的问题；并且IOnm直径的介孔碳材料提供了“纳米笼”微环境(“空间限制效应”)固定酪氨酸酶分子(6. 5nmX9. 8nmX5. 5nm),空间限制效应能够防止酶分子去折叠失活，提高了酶在体外的长期稳定性和生物活性。同时酶分子与导电基底之间由于距离较近而减少了长程电子运输，利于电化学换能；介孔碳多孔的网络骨架结构还可以为酶反应的底物和产物提供通过的通道，提高传感器的响应速度和灵敏度。此外，本专利技术使用的亲水性离子液体(BMIM[Ala)对含苯环(通过π电子)和羟基(通过氢键)的酚类污染物具有较强的相互作用，可以通过富集效应进一步提高检测的灵敏度。本专利技术检测的水体中酚类污染物通过电化学检测前后信号的变化，检测分析水体环境中酚类污染物的浓度。目标分析物为实际水体样品时，可以通过电化学分析检测确定样品中是否含有酚类污染物及其对应总浓度。酪氨酸电化学传感器的制备与样品的检测过程可以分为以下四个步骤I)介孔碳材料与室温离子液体(BMM[Ala])在室温下超声震荡30分钟。2)将酪氨酸酶加入到离子液体修饰介孔碳材料的液相溶液中，4°C低温振荡一小时。3)成膜能力和粘着力极好的生物相容性壳聚糖加入到酶分子和介孔碳形成的超分子组装体溶液中，取4μ L的上述溶液滴加到打磨处理干净的玻碳电极表面。4)将待检测的酚类污染物水溶液滴加到检测缓冲溶液中，进行电化学扫描并记录响应信号。本专利技术使用电流信号升高的强度检测分析酚类化合物浓度Ia为修饰后玻碳电极在空白缓冲溶液中扫描的电流，即背景溶液扫描的电流；ib为酚类污染物溶液滴加到检测缓冲溶液后扫描的电流为酚类污染物溶液处理前后电流信号变化量。电流信号变化公式如下w = Ib-Ia所述的离子液体在水相中对介孔碳表面进行可控的亲水改性，使离子液体在介孔碳表面形成近“单层”或多层的修饰；酪氨酸酶被诱陷到离子液体亲水改性的介孔碳材料中，利用介孔的“空间限制”效应，防止酶分子的去折叠失活；氨基酸离子液体中的氨基酸为酪氨酸酶分子提供了更加友好的微环境，提高了酪氨酸酶分子的长期稳定性。本专利技术采用一种高灵敏度、高选择性、低检测限、可靠便携、具有长期的操作和存储稳定性的酪氨酸酶生物传感器，进行水体环境中酚类化合物的检测。相对于现有技术，本专利技术具有如下优点I、步骤简单，稳定性好，结果准确可靠。酪氨酸电化学传感器对水体环境样品中酚类污染物的检测不需要复杂的样品预处理，简化了操作步骤；亲水性氨基酸离子液体改性的介孔碳材料作为固定基底，介孔碳提供了一个“纳米笼”微环境(空间限制效应)防止酶分子的去折叠失活，亲水性氨基酸离子液体的生物相容性特征为酶分子提供了更加友好的微环境，极大提高了酶分子的长期稳定性和生物催化活性。2、灵敏度高，检测限低。酶分子与导电基底之间由于距离近从而缩短了电子传输距离，利于电化学换能；介孔碳材料多孔的网络骨架结构还可以为酶反应的底物和产物提供通畅的通道，提高传感器的响应速度和灵敏度；此外生物相容性室温离本文档来自技高网...
【技术保护点】
酶电化学生物传感器检测水体环境中酚类化合物的方法，其基于三电极系统，该方法包括以下步骤：a).有序介孔碳材料的制备取1？5g直径为5？50nm的纳米硅球(SiO2)，随后向SiO2中加入3mL0.024g？mL？1的Ni(NO3)2·6H2O的乙醇水溶液(V乙醇∶V水＝1∶1)；浸渍过Ni(NO3)2·6H2O的SiO2在烘箱中干燥，然后将干燥后的SiO2在压片机上压成薄片；向10mL苯乙烯单体中加入150μL浓硫酸(质量浓度98％)酸化处理10？30分钟；将10mL酸化后的苯乙烯滴加到1？5g浸渍过Ni(NO3)2·6H2O的SiO2薄片上，120？200℃下反应，然后将苯乙烯和SiO2的复合物移入管式炉中，在高纯惰性气体(氮气或氩气等气体)保护下升温至750？950℃热解2？5h；将热解产物加入质量浓度为15？30％HF溶液中搅拌去除SiO2模板，过滤得到孔径为5？50nm的介孔碳；b).有序介孔碳的表面改性和功能化将0.2？0.8mg介孔碳材料加入到1mL？0.56mg？mL？1亲水性离子液体中超声振荡；利用含咪唑阳离子的亲水离子液体与介孔碳之间固有的强相互作用，使离子液体在介孔碳表面形成近单层或多层修饰，可以获得亲水性离子液体功能化的介孔碳复合材料；c).酶生物传感器的构建在亲水性离子液体功能化的介孔碳复合材料溶液中加入等体积的2.5？20mg？mL？1的酶溶液，4℃低温振荡0.5？3小时，通过介孔材料的虹吸作用将酶分子诱陷到介孔碳的介孔中形成超分子自组装体，然后取3？10μL的超分子自组装体溶液滴加到电极表面，得到酶修饰电极；d).将c)中所述的酶修饰电极作为工作电极放入空白检测溶液(50mmolL？1磷酸缓冲液)中，进行电化学扫描并记录响应信号Ia，将酚类化合物作为目标分析物加入到空白检测溶液中，进行电化学扫描并记录响应信号Ib；随着加入酚类目标物浓度的升高，酶生物传感器产生的电流信号逐渐增强，并且在0.5？10μmol？L？1范围内线性相关；以酚类目标分析物浓度(c)为横坐标，其对应产生的电流信号强度(Ib？Ia)为纵坐标，绘制出酚类目标物浓度与电流信号强度的线性相关曲线；e).将含有酚类化合物的检测样品加入到c)中所述的酶修饰电极的空白检测溶液中，进行电化学扫描并记录响应信号Ib，并将其产生的电流上升量(Ib？Ia)带入线性相关曲线中就可以评估出检测样品中酚类化合物的浓度。...
【技术特征摘要】
1.酶电化学生物传感器检测水体环境中酚类化合物的方法，其基于三电极系统，该方法包括以下步骤a).有序介孔碳材料的制备取l-5g直径为5-50nm的纳米硅球(SiO2)，随后向SiO2中加入3mL0. 024g mL—1的 Ni (NO3)2 · 6H20的乙醇水溶液(V [醇:V水=I : I);浸溃过Ni (NO3)2 · 6H20的SiO2在烘箱中干燥，然后将干燥后的SiO2在压片机上压成薄片；向IOmL苯乙烯单体中加入150 μ L浓硫酸(质量浓度98% )酸化处理10-30分钟；将 IOmL酸化后的苯乙烯滴加至Ij l_5g浸溃过Ni (NO3)2 · 6H20的SiO2薄片上，120-200°C下反应，然后将苯乙烯和SiO2的复合物移入管式炉中，在高纯惰性气体(氮气或氩气等气体)保护下升温至750-950°C热解2-5h ;将热解产物加入质量浓度为15-30% HF溶液中搅拌去除 SiO2模板，过滤得到孔径为5-50nm的介孔碳；b).有序介孔碳的表面改性和功能化将O. 2-0. 8mg介孔碳材料加入到ImL O. 56mg mL—1亲水性离子液体中超声振荡；利用含咪唑阳离子的亲水离子液体与介孔碳之间固有的强相互作用，使离子液体在介孔碳表面形成近单层或多层修饰，可以获得亲水性离子液体功能化的介孔碳复合材料；c).酶生物传感器的构建在亲水性离子液体功能化的介孔碳复合材料溶液中加入等体积的2. 5-20mg ml/1的酶溶液，4°C低温振荡O. 5-3小时，通过介孔材料的虹吸作用将酶分子诱陷到介孔碳的介孔中形成超分子自组装体，然后取3-10 μ L的超分子自组装体溶液滴加到电极表面，得到酶修饰电极；d).将c)中所述的酶修饰电极作为工作电极放入空白检测溶液(SOmmoir1磷酸缓冲液)中，进行电化学扫描并记录响应信号Ia，将酚类化合物作为目标分析物加入到空白检测溶液中，进行电化学扫描并记录响应信号Ib ;随着加入酚类目标物浓度的升高，酶生物传感器产生的电流信号逐渐增强，并且在O.5-10 μ mo I I/1范围内线性相关；以酚类目标分析物浓度(c)为横坐标，其对应产生的电流信号强度(Ib-Ia)为纵坐标，绘制出酚类...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴立冬，卢宪波，苏凡，陈吉平，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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