本发明专利技术公开了属于免疫检测技术领域的一种人体液HSP70胶体金标检测试纸条及其制备方法，此试纸条包括设在固定板上依次相连的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；在硝酸纤维素膜上设有三条检测线和一条质控线：在金标垫上设有金标抗体。金标抗体为显色抗体，所述检测线为捕捉抗体，显色抗体与捕捉抗体为1对双抗体夹心配对的鼠抗人HSP70单克隆抗体，质控线为羊抗鼠IgG。本发明专利技术的人体液HSP70胶体金标检测试纸条，特异性高，结果易观察，灵敏度达到15ng／mL，15min内就能判读结果，具有良好的稳定性和重复性，操作简便，无需特殊仪器设备，适宜在现场检测基层医院和实验研究推广和应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学分析
，具体涉及一种人体液中HSP70胶体金标检测试纸条及制备方法。
技术介绍
热休克蛋白家族(HSPs)是一类高度保守的蛋白，热休克蛋白70 (heat shockprotein 70, HSP70)是热休克蛋白家族中的重要成员，其分为诱导型的组成型的。当机体受到外界环境中多种不良因素刺激时，诱导型的HSP70蛋白表达升高。HSP70蛋白对细胞损伤的修复、存活和维持正常的细胞功能是必需的。在环境刺激、病原菌感染、疾病引起细胞应激损伤中发挥分子伴侣作用，阻止蛋白聚集，促进损伤蛋白的重新折叠。在大多数的哺乳动物，只有在应激条件下诱导型HSP70表达，而且显著的细胞和机体应激后才能检测到，但是在人和灵长类，诱导型的HSP70有一个基准值，在一些特殊条件下如过热、化学有毒物·质暴露、缺氧、缺体、感染、自身免疫性疾病、凋亡、器官移植、细菌和病毒引起的感染，动脉粥样硬化等心体管疾病中，生物体的HSP70表达显著升高；在正常老化过程，精子发生，月经，运动练习等正常生理过程中，生物体的HSP70表达也显著升高，提示其在这些过程中可能发挥重要作用。酶联免疫吸附分析(enzymelinked immμ nosorbent assay, ELISA)技术是目前进行体液生物蛋白检测最为常用的方法，与其他检测方法相比，ELISA检测方法具有成本低、检测设施设备简单、快速高效的特点，并在不断改进当中，已经有直接ELISA、间接ELISA、单抗体ELISA，微波ELISA、双抗体夹心ELISA方法。但是ELISA方法，目前只适用于实验室检测，不能适用于现场检测。应激是机体在对生存环境中多种不利因素适应过程中，实际或认知上的要求与适应和应付能力之间不平衡导致的身心紧张状态及其反应。应激同人的健康有密切联系，这种联系是双向的一方面应激可影响人的健康，另一方面一个人的健康状况也会影响应激条件下心理应激反应的强度和对应激的耐受力。适度的心理应激是人成长和发展的必要条件，适当的应激有助于维持人的生理、心理和社会功能，应对挑战既可以引起我们的紧张、劳累、苦恼和痛苦，又可以为我们带来成功的喜悦、轻松和欢乐。但是长期、超过人适应和应对能力的应激就会损害人的健康，这是心理应激对健康的消极影响，主要表现在下述三个方面。首先，心理应激引起的心理和生理反应可以以症状和体征的形式见之于临床，成为人们身体不适、虚弱和精神痛苦的根源和就医需求帮助的原因；其次，心理应激可以加重已有的精神障碍和躯体疾病，或使这些疾病复发；最后，心理应激可以造成对疾病的易感状态，并且在其他因素的共同作用下导致新的精神障碍和躯体疾病。随着研究的深入，HSP70作为应激的生物标记物，可以检测机体应激水平，预防应激损伤的发生，用于机体应激负荷健康风险评估。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有检测HSP70技术的不足，提供一种人体液HSP70胶体金检测试纸条。本专利技术的目的还在于提供上述检测试纸条的制备方法。一种人体液HSP70胶体金标检测试纸条，此试纸条由设在固定板I上依次相连的样品垫2、金标垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸9组成；在硝酸纤维素膜4上设有第一检测线5、第二检测线6和第三检测线7和一条质控线8 ;在金标垫3上设有金标抗体。固定板I为具有压敏胶的PVC板，样品垫2为玻璃纤维膜，金标垫3为聚酯纤维膜。金标抗体为显色抗体，检测线为捕捉抗体，显色抗体与捕捉抗体为I对双抗体夹心配对的鼠抗人HSP70单克隆抗体。 金标抗体用粒径为20nm-60nm的胶体金颗粒标记。质控线8为羊抗鼠免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)。上述人体液HSP70胶体金标检测试纸条的制备方法，包括以下步骤(I)用常规的柠檬酸三钠还原法制备均匀粒径为20nm-60nm的胶体金；(2)调节上述胶体金pH为8. 5-10，然后加入显色抗体与其反应，其中显色抗体的浓度为O. 04mg/ml，离心得沉淀，重悬沉淀，得金标抗体溶液，将金标抗体溶液用喷墨仪喷印在聚酯纤维膜，晾干；(3)将捕捉抗体用抗体稀释液稀释成浓度为lmg/ml的捕捉抗体溶液，用喷墨仪将捕捉抗体溶液在硝酸纤维素膜上喷划三条平行检测线，真空干燥；(4)将羊抗鼠IgG用抗体稀释液稀释成浓度为O. 5mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，用喷膜仪将抗体喷线在硝酸纤维素膜上形成质控线，真空干燥；(5)按样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸水纸顺序粘贴在固定板上，切条，装入塑料袋，干燥包装。离心的方法为反应液于5000xg离心30min，沉淀用lwt%牛血清白蛋白溶液重悬浮，反复2次；其中I wt %牛血清白蛋白溶液为IOmM的Tris-HCl缓冲溶液，pH为8. 5，含lwt%的牛血清白蛋白。步骤(2)中重悬沉淀的溶液为20mM的Tris-HCl缓冲溶液，pH为8. 5，其中含30wt%的海藻糖，lwt%的牛血清白蛋白，Iwt %的酪蛋白，体积浓度为O. 01%的Tween-20,O. 02 wt % 的 NaN3。抗体稀释液为IOmM的磷酸盐缓冲溶液，pH为7. 6，其中含10wt%的海藻糖，体积浓度为3%的甲醇。本专利技术的有益效果为用于人体液HSP70用于人体液HSP70检测，检测灵敏度高，准确性强、成本低，结果易观察，灵敏度达到15ng/mL，15min内能判读结果，具有良好的稳定性和重复性，操作简便，无需特殊仪器设备，可用于机体应激水平的监测，和其他疾病的辅助检查，适宜在现场检测基层医院和实验研究推广和应用。附图说明图I为试纸条的结构示意图；其中各标号为I-为固定板，2-为样品垫，3-为胶体金垫，4-为硝酸纤维素膜，5-第一检测线，6-第二检测线，7-第三检测线，8-为质控线，9-吸水纸。图2为试纸条测试结果判定示意图。图3为HSP70单克隆抗体纯化产物SDS-PAGE电泳分析图。具体实施例方式下面将结合附图和具体实例对本专利技术作进一步的说明。实施例I试纸条的制备和检测以下述方式进行(I)胶体金颗粒制备将HAuCl4配制成浓度为O. Olwt%水溶液，取IOOml加热至沸。搅动下准确加入2ml的lwt%柠檬酸三钠(C6H5Na3O7CH2O)水溶液。继续加热煮沸 15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变为灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。(2)胶体金质量的分析采用多功能酶标仪对胶体金进行波长在400 800nm范围光密度扫描，获得其最大吸收波长和半峰宽。根据最大吸收波长判断粒径大小，根据半峰宽判断粒径均一程度。(3)显色抗体金标记用K2CO3调整胶体金的pH值到8. 5,于IOOml金纳米颗粒溶液中滴加显色抗体4mg，搅拌5min，避光静止放置30min，再加入25ml 5wt% BSA溶液(用IOmM的Tris-HCl缓冲溶液，pH为8. 5配制)，封闭2h以上，反应液5000xg离心30min，沉淀用125ml的lwt% BSA溶液(用IOmM的Tris-HCl缓冲溶液，pH为8. 5配制)重悬浮，反复处理2次，沉淀用Iml重悬液重悬沉淀，得到金标抗体。(4)金标垫的制备将金标抗体用喷膜仪喷印在聚脂纤维素膜上，干燥，用量最优为 2 μ I /cm。(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人体液HSP70胶体金标检测试纸条，其特征在于：此试纸条由设在固定板（1）上依次相连的样品垫（2）、金标垫（3）、硝酸纤维素膜（4）和吸水纸（9）组成；在硝酸纤维素膜（4）上设有第一检测线（5）、第二检测线（6）和第三检测线（7）和一条质控线（8）；在金标垫（3）上设有金标抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：钱令嘉，弓景波，王新兴，战锐，杲修杰，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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