本发明专利技术公开了一株脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌及其构建方法。本发明专利技术提供重组菌A，为去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因得到的重组菌。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术首先依据质粒不相容原理将野生福氏志贺菌2a?301株的毒力大质粒驱除，构建得到了毒力大质粒无痕缺失突变株301ΔpCP，即一株无毒福氏志贺氏菌，然后利用基于λ噬菌体Red重组酶作用的同源重组技术，靶基因被抗性基因置换下来；随后抗性基因通过转座酶的作用从宿主菌种脱落，从而得到无毒志贺氏菌的waaI缺失株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及。
技术介绍
志贺氏菌(Shigella spp.)俗称痢疾杆菌，作为ー种具有高度传染性革兰氏阴性肠道致病菌，主要通过侵入人结肠上皮细胞最終定位于大肠，而引起典型细菌性痢疾(发热、腹痛、里急后重、大便脓血)，而毒カ大质粒则是其致病性的最主要的因素，包含有大概32个与毒力有关的基因，主要包括与III型分泌系统有关的mxi-spa基因，与细菌侵入上皮细胞密切相关的ipaB⑶，以及ipgC等毒力基因。志贺氏菌感染剂量极低(10-100个细菌)，2010年我国卫生部公布的全年法定 50-70%，次于病毒性肝炎，肺結核和梅毒。目前治疗痢疾的主要方式是抗生素，但不同菌群及血清型之间虽然无交叉免疫，但存在交叉抗药性，加上临床分离多重耐药菌株的不断增カロ，常规的抗生素治疗遇到了巨大的挑战；由于急性期治疗不及时、对耐药菌株用药不当、治疗不彻底等原因可导致急性菌痢转变成慢性菌痢，故对细菌性痢疾的治疗方式受到越来越严峻的挑战。因此，开发针对细菌的多糖疫苗重新引起了人们的研究兴趣。在疫苗生产中，通常是使用的减毒(或无毒)病原菌(病毒)，所以需获得无毒菌株，而志贺氏菌的毒力大质粒是其致病性的主要因素。
技术实现思路
本专利技术的ー个目的是提供ー种重组菌A。本专利技术提供的重组菌A，为去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因得到的重组菌。上述福氏2a志贺氏菌为福氏2a志贺氏菌301，上述毒カ大质粒为pCP301。本专利技术的另ー个目的是提供一种制备上述重组菌A的方法，包括如下步骤去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因，得到重组菌A。上述方法中，所述去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因为依次去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因。上述方法中，所述去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒的方法包括如下步骤 I)将与所述毒カ大质粒不相容的质粒导入所述福氏2a志贺氏菌中，得到中间重组菌I (通过抗生素抗性筛选)；2)去除所述中间重组菌I中的所述与毒カ大质粒不相容的质粒，得到去除毒カ大质粒的重组菌B ；所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因的方法包括如下步骤3)将抗性筛选标记物基因替换掉所述重组菌B基因组中的O-抗原连接酶基因，得到去除O-抗原连接酶基因的中间重组菌2 ；4)去除所述中间重组菌2中的所述 抗性筛选标记物基因，得到所述重组菌A。上述方法中，步骤2)包括如下步骤在40°C _42°C培养所述中间重组菌1，以去除其中的毒カ大质粒，得到去除毒力大质粒的重组菌B;所述培养为至少培养3代，所述毒カ大质粒为PCP301 ；步骤3)包括如下步骤先将含有编码λ -Red重组系统所需酶的质粒导入所述重组菌B，得到中间重组菌3，再将含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段导入所述中间重组菌3中，得到中间重组菌4 (通过抗生素抗性筛选);再将所述中间重组菌4在40°C -42°C培养，得到中间重组菌2，所述培养为传代至少2次，毎次至少13小时；步骤4)包括如下步骤先将编码FLP重组酶的质粒导入中间重组菌2中，得到中间重组菌5，再将所述中间重组菌5在40°C _42°C培养，得到所述重组菌A，其中，所述培养为连续培养2代，培养时间为至少12小吋。上述福氏2a志贺氏菌为福氏2a志贺氏菌301，上述毒カ大质粒为pCP301。上述方法中，步骤I)中，所述与毒力大质粒不相容的质粒为pKDinc ;步骤3)中，所述抗性筛选标记物基因为卡那霉素基因；所述含有编码λ -Red重组系统所需酶的质粒为质粒pKOBEG ；所述含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列I ;步骤4)中，所述编码FLP重组酶的质粒为质粒pCP20。上述方法中，步骤3)中，在所述再将含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段导入所述中间重组菌3中的步骤前还包括将所述中间重组菌3经L-阿拉伯糖诱导培养的步骤。本专利技术的第三个目的是提供一种制备重组菌B的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤去除福氏2a志贺氏菌中的毒カ大质粒，得到重组菌B。上述方法中，所述去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒的方法包括如下步骤I)将与所述毒カ大质粒不相容的质粒导入所述福氏2a志贺氏菌中，得到中间重组菌I (通过抗生素抗性筛选)，2)去除所述中间重组菌I中的所述与毒カ大质粒不相容的质粒，得到去除毒カ大质粒的重组菌B ；步骤2)具体包括如下步骤在40°C _42°C培养所述中间重组菌1，得到去除毒力大质粒的重组菌B ;所述与毒力大质粒不相容的质粒具体为pKDinc。上述福氏2a志贺氏菌为福氏2a志贺氏菌301，上述毒カ大质粒为pCP301。由上述的方法制备得到的重组菌B也是本专利技术保护的范围；或ー种DNA分子也是本专利技术保护的范围，该DNA分子为如下(I)或⑵或(3):(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交的DNA分子；(3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的DNA分子。本专利技术的实验证明，本专利技术首先依据质粒不相容原理首先将野生福氏2a志贺菌301株的毒カ大质粒驱除，构建得到了毒力大质粒无痕缺失突变株301 Δ pCP，即ー株无毒福氏志贺氏菌，然后利用基于λ噬菌体Red重组酶作用的同源重组技术，其原理是将一段与靶基因两翼400-600bp同源线性序列导入宿主菌细胞；在λ噬菌体Red重组酶的作用下，线性DNA片段两侧的同源臂与染色体(或载体)的靶序列发生同源重组，靶基因被标记基因置換下来；随后抗性基因通过转座酶的作用从宿主菌种脱落，从而得到无毒志贺氏菌的waal缺失株。附图说明 图I为毒カ大质粒无痕缺失突变株(301 Δ pCP)的PCR验证图2为突变体检测引物位置示意3为同源重组原理敲除基因示意4为301 ApCPAraaI基因缺失突变株PCR验证图5为301 ApCPAwaaI和野生型301的银染图具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌一、缺失O-抗原连接酶(waal)基因的无毒福氏志贺氏菌2a 301的制备I、福氏志贺氏菌2a 301毒力大质粒缺失株301 ApCP的构建A、制备了福氏志贺氏菌2a 301野生株感受态I)将福氏志贺氏菌301野生株(即为福氏2a志贺氏菌301 (Shigellailexneri2a)j01, benome sequence of bnigella rlexneri 2a insights intopathogenicity through comparison with genomes of Escherichia coll K12and 0157，Nucl. Acids Res 2002,30(20本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组菌A，为去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O？抗原连接酶编码基因得到的重组菌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王恒樑，朱力，宋丽，冯尔玲，刘先凯，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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