本发明专利技术公开了一种烟蚜hunchback基因的cDNA及其应用，通过将烟蚜（Myzuspersicae）胚胎发育关键基因hunchback（Mphb）cDNA转到植物中，获得表达MphbdsRNA的能抑制烟蚜繁殖的转基因植物，烟蚜取食转基因烟草后，Mphb表达受抑制，烟蚜胚胎发育受阻，日平均产蚜数减少，繁殖能力下降，从而用于烟蚜的生物防治。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于昆虫分子生物学与植物基因工程领域，具体涉及一种烟蚜胚胎发育关键基因hunchback (.Mphb ) cDNA的克隆，表达Mphb dsRNA转基因烟草的获得。
技术介绍
刺吸式口器害虫是一类重要的农业害虫，主要包括同翅目、半翅目、及部分双翅目昆虫，如稻飞虱，稻叶蝉，棉盲蝽及各种蚜虫等。刺吸式口器害虫常群居于嫩枝、叶、芽、花蕾、果上，汲取植物汁液，掠夺其营养，造成枝叶及花卷曲，甚至整株枯萎或死亡。如稻飞虱一般危害损失为2到3成，严重危害损失3到5成，甚至绝收。而棉盲蝽近年来已上升为棉田主要害虫,转基因抗虫棉被棉盲蝽为害后,蕾铃大量脱落,成铃率明显降低,棉花产量与品质大幅度下降。刺吸式口器害虫还能传播各种病毒，蚜虫传播植物病毒病的能力更是居病毒媒介昆虫的首位，仅桃蚜一种至少可传播107种植物病毒病，棉蚜一种至少可传播55种植物病毒病。传播病毒病所造成的危害往往远远超过蚜虫本身造成的危害(宋新元，2005)。烟蚜是重要的刺吸式口器害虫，食性杂，寄主广泛，除危害烟草夕卜，还危害桃、李、梨等果树、油菜、白菜、甘蓝、芥菜、萝卜等十字花科蔬菜以及瓜类、茄类和多种花卉林木。烟蚜发生数量大，危害时间长。若蚜或成蚜以口针刺入叶肉、嫩茎或嫩蕾、花、果吸食汁液，严重时致失水而叶片卷缩、变形，生长缓慢，组织破坏甚至死亡。烟蚜还可传播黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)等多种病毒，对农业生产造成重大损失。目前，刺吸式口器害虫防治主要依赖于具有强触杀作用和内吸作用的化学农药，如乐果、马拉硫磷和溴氰菊酯等。化学杀虫剂在害虫防控中发挥了重要作用，但长期使用会破坏生态环境，危害人类健康。常规育种在抗虫作物品种培育中发挥了重要的作用，但单纯的常规育种手段周期较长，且受远缘杂交不亲和的限制，远缘物种的优良抗虫基因难以被快速有效地利用。一些病原微生物能诱发刺吸式口器害虫流行病，但多数是昆虫专性病原真菌，一般较难培养和生产，目前在实际应用方面还存在一定困难。通过白僵菌、绿僵菌等生防真菌以及信息素、植物凝集素防治刺吸式口器害虫尚处在研究与探索阶段，目前国内尚未有针对刺吸式口器害虫的高效生物农药在大田推广应用。而天敌昆虫如瓢虫、蚜茧蜂、草蛉等的大规模饲养和释放还比较困难，成本较高，短期内难以发展成为一种常规生防措施在农业生产上大面积推广应用。随着现代生物技术的发展，植物基因工程在农业上的应用取得了巨大的进展，目前己有转基因植物抗刺吸式口器害虫的报道，所用的基因主要有Bt蛋白基因，蛋白酶抑制剂基因，植物凝集素基因。而且有报道称，害虫对转基因植物的耐受性有上升的趋势。RNA干扰(RNA Interference,RNAi)是由双链RNA(double stranded RNA, dsRNA)引起的同源mRNA特异性降解的现象,小RNA(siRNA和microRNA)在RNA干涉机制中发挥关键作用。RNA干涉普遍存在于植物、动物和真菌中，是真核生物中存在的一种抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。RNAi技术在农业害虫生物防治领域具有广阔的应用前景。1998年,有科学家首次利用RNAi技术研究了黑腹果蝇与frizzled2基因的功能。随后的众多研究也表明，在注射或进食靶标序列dsRNA后，昆虫靶标基因的表达也可被有效阻断。通过体外显微注射dsRNA可以成功敲除刺吸式口器害虫稻飞虱不同表达模式的基因。黄曲条跳甲在注射跨膜气味受体基因dsRNA后，对十字花科寄主的偏好性减弱。在人工饲料中添加三磷酸腺苷酶基因dsRNA后，玉米根萤叶甲iicavirgifera rirgi/era)三磷酸腺苷酶基因表达明显受抑制,幼虫生长停滞甚至死亡。棉铃虫有一受棉酚诱导的P450全长基因GIP,当棉铃虫幼虫进食表达P450全长基因GIP dsRNA的转基因烟草后，幼虫中肠组织中GIP的转录水平被显著抑制并伴随过氧化氢酶活性的上升，同时由于棉铃虫中肠内的表达的下调而使幼虫生长受到抑制，对棉酚的耐受性降低。此外，通过dsRNA饲喂对白蚁内源纤维素基因与Hexamerin储存蛋白基因的干扰具有致死与致畸效应。经dsRNA饲喂后默R比亚按蚊的几丁质酶基因可被有效沉默。有报道称在水稻中表达跨膜转运蛋白基因或羧肽酶基因dsRNA可提高水稻对稻褐飞虱的抗性。除在害虫生物防治中的应用外，RNAi技术也是昆虫功能基因组研究的重要手段，目前已被广泛应用于昆虫胚胎发育的基因调控研究，但主要限于有性繁殖的昆虫如果蝇、谷盗和金小蜂等。间隙基因m编码一含锌指的转录因子，是昆虫胚胎发育中负责体·节分化的关键基因之一，研究表明其在膜翅目，直翅目，双翅目，鞘翅目等昆虫中普遍存在，但拷贝数存在差异。从mRNA可由母体提供,也可在合子中合成。母体M mRNA合成受后端母体因子(nos)的调控，而合子的mRNA则受前端母体基因AicoitZ (bed)的控制。在果妮中，从与orthodenticle {otd)基思是bicoid Ocor)基因的下游革G基因，ActZ和从的互作激活W和另外两个前端间隙基因spiracles (ems)和buttonhead(btd)的表达。此外,从被发现在果蝇中枢神经系统细胞分化中发挥重要作用。昆虫M基因的沉默具有强烈的致畸与致死效应。果蝇功能缺失会导致颌和胸部体节的缺失。通过RNAi沉默拟谷盗属Tribolium和金小蜂yVasoflia的母体或合子A办基因后，其头部和胸部会发生缺陷。这些研究表明胎胚发育关键基因是害虫生物防治的一个潜在靶标。在目前膜翅目(如蚊子)、直翅目(如蝗虫)、半翅目(如蝽蟓)等昆虫的从基因部分mRNA序列已能查询。豆虫牙(Acyrthosiphon pi sum)全基因组序列已公布，豆虫牙力办(,Aphb )基因以单拷贝存在。但目前烟姆hunchback iMphb )尚未被克隆,更没有以Mphb为靶标来防治烟蚜的研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种烟姆(妙^ 5· persicae、hunchback基通(Mphb)的cDNA及其应用，通过将烟蚜胚胎发育关键基因i^AkDNA转到植株中，获得表达Mphb dsRNA的能抑制烟蚜繁殖的转基因植物(特别是烟草)，烟蚜取食转基因烟草后，Mphb表达受抑制，烟蚜胚胎发育受阻，日平均产蚜数减少，繁殖能力下降，从而用于烟蚜的生物防治。本专利技术提供的技术方案是一种物从基因的cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。该序列是专利技术人首次从烟蚜中克隆的#/ 基因，该基因能够作为RNAi的靶标，在烟蚜的防治中具有很大的应用价值。本专利技术还提供所述cDNA编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。一种所述cDNA的克隆方法，包括以下步骤 (O从烟蚜成虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA ； (2)设计简并引物，所述简并引物正向序列如SEQID NO. 3所示，反向序列如SEQ IDNO. 4所示； (3)以步骤(I)得到的cDNA为模板，用步骤(2)所述的引物进行PCR扩增； (4)纯化步骤(3)得到的PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pMD18-T载体上得到pMD18-T-i^^i，然后转化大肠杆菌感受态细胞T本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Mphb基因的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：毛建军，曾凡荣，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
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