本发明专利技术属于微生物学，分子生物学及免疫学领域，涉及牛乳腺炎奶样中金黄色葡萄球菌来源的粘附素分子FnBPA核酸疫苗的设计和制备使用。通过对来源于奶牛乳腺炎地区分离株FnBPA的部分基因的克隆，分析其序列及抗原表位，筛选抗原表位，设计并构建表达载体获得了针对FnBPA分子特定表位的DNA疫苗。该DNA疫苗能刺激小鼠产生持久和显著的特异性淋巴细胞增殖反应以及一定的体液免疫，与相应的空载体接种的阴性对照组比较，差异显著(P＜0.05)。同时攻毒实验的结果表明该核酸疫苗能对免疫小鼠起到免疫保护的作用，该核酸疫苗能够安全、有效地防治奶牛乳房炎且无药物残留，对奶牛乳腺炎的防治具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中的疫苗及其构建方法，尤其是涉及FnBPA分子为靶标的DNA疫苗及其构建方法。更具体地说，本专利技术涉及抗奶牛乳腺炎的核酸疫苗和编码该疫苗的粘附素分子的特定核苷酸序列，抗原表位和表达方式。
技术介绍
由金黄色葡萄球菌引发的奶牛乳腺炎在世界范围内都造成了巨大的损失。截止2011年我国奶牛存栏头数1300万头，毎年由乳腺炎造成的经济损失可达40亿元。近些年来，抗生素的大量使用甚至滥用，使金黄色葡菌球菌的抗菌谱逐渐扩大，给临床治疗和预防金黄色葡菌球菌乳腺炎提出了新的挑战。目前认为疫苗是防控金黄色葡菌球菌感染的有效方法。 迄今金黄色葡萄球菌疫苗研制经历了全菌灭活苗、亚单位疫苗和DNA疫苗3次重大变革。1902年，Wright将体外培养的金黄色葡萄球菌全菌灭活，制成灭活苗免疫牛，结果免疫效果不理想，不能有效抵抗新的感染发生(赫娜，杨宏军，王长法等.奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌疫苗研究进展.动物医学进展，2009，30 (I) :93-96.)林峰强等(林峰强，胡松华，胡奇林等.奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎菌苗佐剂研究现状.动物医学进展，2004，25(6) 49-51.)针对灭活苗的不足研制出了针对金黄色葡萄球菌单ー成分的亚单位疫苗。目前，部分亚单位疫苗已应用于生产中，如在美国获准使用的Soma-to-Staph和Lysigin 2种金黄色葡萄球菌疫苗及大肠杆菌J5菌苗均是基因工程亚单位疫苗。目前，在奶牛乳腺炎疫苗的研制方面，国内起步较晩。金黄色葡萄球菌黏附素纤连蛋白结合蛋白A(FnbpA)是细菌感染的先决条件(周宏，李韩平.金黄色葡萄球菌表面蛋白研究进展.生物技术通讯，2004，15 (I) :73-75.)，抑制其活性后可从根源上切断金黄色葡萄球菌感染的途径。几乎所有的金黄色葡萄球菌都拥有FnbpA基因，都可以表达纤连蛋白结合蛋白A，此蛋白由于具有与宿主组织的特异黏附能力，正成为抗金黄色葡萄球菌感染疫苗开发的热点分子。国内研制的FnBPA重组蛋白疫苗疫苗首免后7d，在免疫组小鼠血清中即可检测到抗体，而且随着免疫时间的延长，抗体效价呈明显的上升趋势，在21d达到最高水平，之后抗体水平逐渐降低。通过对小鼠的免疫攻毒试验可知，FnBPA基因工程亚单位疫苗可有效提高小鼠的抗体水平，免疫保护指数PI达80%，说明疫苗对金黄色葡萄球菌具有较强的免疫保护力。(张海燕，杨宏军，王长法等.重组金黄色葡萄球菌FnbpA亚单位疫苗的研制.西北农林科技大学学报.2011，5 (39) :39-43.)。虽然基因工程亚单位疫苗具有抗原剂量大、纯度高且无遗传物质及宿主和培养基的成分等优点(张延龄，张晖.疫苗学.北京科学出版社2004 :345-377,421-504.)。此外基因工程亚单位疫苗诱导大动物的免疫应答持续时间短，且大动物的免疫成本高。为克服这些缺点，我们选择了针对FnBPA的核酸疫苗。核酸疫苗又称基因疫苗、DNA疫苗，是把外源基因克隆到质粒或病毒载体上，用重组质粒或病毒DNA直接免疫，使外源基因在活体内以天然蛋白的形式呈递抗原，激活机体免疫系统，井能持续的引发免疫反应。其无毒性返祖现象，对病毒变异株也起作用。因此DNA疫苗是近年来备受人们关注的ー种新型疫苗。Nour等研制了 CTLA4和ClfA的重组核酸疫苗并采用了共聚物阳离子包装先用核酸疫苗免疫奶牛2次，3个月后再用200 μ g的ClfA重组蛋白加强免疫一次，免疫牛产生了较强的体液免疫及细胞免疫反应(Adel NM Nour Eldin, Lulzim Shkreta, Br IanG Talbot，et a. I DNA imunization of dairy cows with the clumping factor A ofStaphylococcus aureus. Vaccine，2006，24 :1997-2006.)。国外已有基于 FnBP 的黏附机制来研制金黄色葡萄球菌DNA疫苗的报道。目前FnBP分子结构中的D区被称作配体結合区，被认为是主要的免疫优势表位，在目前研制的金黄色葡萄球菌核酸疫苗中占有重要的作用。专利技术目的研究证实，不同来源的奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌产生的黏附素有一定差异。而且不同地区流行的菌株所产生的黏附素有一定差异。目前国内有关粘附素分子FnBPA的疫苗大多为亚单位疫苗，且抗原表位多针对配体结合区D区设计。因此为克服不同 来源菌株粘附素分子的差异，并且也为克服亚单位疫苗免疫应答持续时间短，且制作的成本高的缺点，本专利技术以FnBPA为免疫靶标，且抗原表位主要针对配体结合区A区及B区的序列设计的奶牛乳腺炎核酸疫苗。
技术实现思路
(I)本专利技术的目的之ー是提供了ー种核酸疫苗的设计以克服亚单位疫苗的不足。(2)为解决上述的技术问题，本专利技术采取了以下技术方案在抗原表位的选择上选择了本地区流行株FnBPA基因的A区和B区，克服了不同来源的奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌产生的粘附附素对本地疾病的免疫造成的差异。(3)所述的免疫靶基因位于真核表达载体PVAX-I中，此外还包括所有能在真核细胞中表达的载体pcDNA3. 1，pEGFP-Nl, pLXSN等载体。(4)本专利技术的第二个目的是提供一种本专利技术预防奶牛乳腺炎的核酸疫苗PVAX-Fn的设计及其构建方法。(5)本专利技术预防奶牛乳腺炎核酸疫苗PVAX-Fn的设计及其构建方法，可包括以下步骤(A)用引物 koF5，CGG GAT CCG GAA ATG GCT AAC GTT AAT CAT AT 3，，koR5，GCGCTC GAG CTA TTC AAT GTA TCC GTC AAC 3’。将 Kozak 序列与我们所选择的 FnBPA 基因的优势抗原表位相连接；(B)再将此连接好的基因片段连接到真核表达载体BamH I和Xhol I中；(C)在此以PVAX-I为出发载体。(6)本专利技术以上技术方案提供了一种以金黄色葡萄球菌FnBPA基因为靶标的核酸疫苗的设计和构建方法。本专利技术的特点可总结为该疫苗是针对当地流行菌株的抗原特点和分子流行特点而设计，免疫的抗原表位的选择不同于其他的研究，选择了 FnBPA基因的A区及B区的部分序列作为抗原表位，使用更为有效；该设计可增加疫苗DNA编码序列在抗原提呈细胞中的表达水平，能够较快的建立起免疫保护机制并具有长期而有效的保护作用，提高DNA疫苗的免疫活性。本专利技术在奶牛乳腺炎防治中新型疫苗的研制与开发方面发挥重要的作用，应用前景广阔。专利技术效果(I)本专利技术与亚单位疫苗相比，制作简单且成本降低。(2)本专利技术中将Kozak序列与抗原表位相连可增加抗原在细胞内的表达水平。(3)本专利技术与亚单位疫苗相比免疫应答持续时间长，可达3个月以上。(4)免疫后3个月攻毒保护效果可达66 %。(5)免疫表位的设计不同于以往的表位选择，考虑了不同地区菌株存在的抗原多态性和对免疫的影响，选择了地区流行株且抗原表位位于FnBPA的A区及B区，该抗原表位的选择可克服不同来源的奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌产生的粘附素差异造成的免疫失败。 附图说明图I是FnBPA基因的PCR扩增结果的电泳图，获得得本地流行菌株的基因组DNA，并用PCR方法扩增FnBPA基因，可在1500bp处见到目的条带。图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种治疗和预防奶牛乳腺炎的核酸疫苗。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苏艳，王世民，张宝江，邵俊高，韦海娜，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。