DCX和SPARC双基因共表达载体在制备放疗增敏剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了DCX和SPARC双基因共表达载体在制备放疗增敏剂中的应用。通过构建DCX和SPARC双基因共表达重组腺病毒载体能够有效提高胶质瘤的放疗敏感性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及ー种基因药物，尤其涉及DCX和SPARC双基因共表达载体在制备放疗增敏剂中的应 用。
技术介绍
胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，故亦称神经外胚层肿瘤或神经上皮肿瘤。脑胶质瘤的基本治疗手段是手术切除+放疗和化疗。随着分子生物学、免疫生物学、肿瘤免疫学和医学生物工程的发展，脑胶质瘤治疗的新方法新技术不断出现，如细胞免疫治疗、分子靶向治疗、热疗等。在这些治疗方法中，各种都有自身的局限性。脑胶质瘤因其恶性程度对放射治疗不甚敏感，一般认为分化差的肿瘤较分化好的为高。放疗的临床效果也不是很令人满意，一是受到放射剂量的限制，再者就是大多数脑胶质瘤细胞对射线具有抗性，加大照射剂量又会増加对周围正常脑组织的辐射损伤。随着基因技术的不断深入研究，如何能利用基因有效治疗胶质瘤已成为当今研究的热点。基因治疗的分子策略主要包括细胞周期调节、自杀基因疗法、免疫基因疗法、抑癌基因治疗、抗血管生成治疗、以及生长因子等。而且于同一载体上同时表达多个外源基因在生物学领域中具有广泛的应用价值，尤其在针对肿瘤等疾病发生发展的各个环节设计多基因共表达载体的联合基因治疗更备受关注。因而构建合适的载体获得多个外源基因的高效转移与表达具有重要意义。双基因或多基因的构建现主要采取两种途径一是将多个携带不同治疗基因的独立载体系统同时转染靶细胞表达多个基因[20]，优点是可以自由调节各表达载体的比例，但是效率太低，载体的副作用明显；ニ是在同一载体上实现多基因共表达，其实现多个基因共同表达的方式主要有在多个基因之间插入独立启动子表达盒、内部核糖体结合位(LRES)或连接2A序列、Furin切割序列等。与多个携带不同治疗基因的独立载体实现共表达相比，于同一载体上实现多基因共表达可提高转移及表达效率。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供ー种DCX和SPARC双基因共表达载体在制备放疗增敏剂中的应用，以解决胶质瘤对放疗不敏感的问题。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是DCX和SPARC双基因共表达载体在制备放疗增敏剂中的应用。具体地，通过构建DCX和SPARC双基因共表达重组腺病毒载体，由重组腺病毒对胶质瘤细胞进行感染，增加G2期细胞的比例，以提高胶质瘤细胞的放射敏感性。所述重组腺病毒载体的构建方法是 (I)针对DCX和SPARC基因序列，制备PCR引物，所述PCR引物由 DCX 正义引物 GCAAGATCTATGAAAACACTCCCCCTTC、DCX 反义引物 TAAGGTACCTTACATGGAATCACCAAGCG、SPARC 正义引物 TAAGCGGCCGCATGAGGGCCTGGATCTT 和 SPARC 反义引物 TAGCTCGAGTTAGATCACAAGATCCTTGT 构成，在 DCX 两端分别引入 BglII 和KpnI酶切位点，SPARC两端分别引入NotI和XhoI酶切位点，扩增得到DCX和SPARC目的片段； (2)双酶切目的基因PCR产物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空载体转移质粒，用T4 DNA连接酶将其4°C连接过夜，构建单、双基因重组转移质粒载体pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter, pAdTrack-CMV-polyA+promoter-SPARC,和 pAdTrack-DCX-poIyA-promo t er-SPARC ； (3)将构建的单、双基因重组转移质粒用PmeI单酶切线性化后，与pAdEasy-Ι腺病毒骨架质粒共转化BJ5183大肠杆菌，用PacI单酶切鉴定并转化DH5 α大肠杆菌；· (4)将成功重组的 pAd-polyA+promoter、pAd-DCX-polyA+promoter>pAd-poIyA+promoter-SPARC 和 pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC 在 DH5 α 大肠杆菌扩增抽提，PacI酶切线性化后用脂质体2000 (Iipofectamine 2000)转染293Α细胞，所得腺病毒为 Ad-GFP, Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC。由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点 本专利技术提供了 DCX和SPARC双基因共表达重组腺病毒载体，获得的腺病毒Ad-DCX-SPARC具有感染细胞的能力，并且显著提高了感染细胞中DCX和SPARC的表达水平，能够有效提高胶质瘤的放射敏感性。附图说明图I是本专利技术实施例中的双基因连接方式示意 图2是腺病毒构建及包装示意 图3是实施例中PCR产物琼脂糖电泳图 4 是实施例中 PacI 单酶切鉴定 pAd-po I yA+pr omo ter、pAd-DCX-po I yA+pr omo t er >pAd-poIyA+promoter-SPARC>pAdTrack-DCX-polyA-promoter-SPARC ； 图5是实施例中RT-PCR鉴定Ad-DCX-SPARC的表达； 图6是实施例中重组腺病毒体外感染U251细胞荧光表达情况； 图7是实施例中腺病毒感染后GFP阳性细胞的比例； 图8是实施例中重组腺病毒对U251生长的影响； 图9是实施例中重组腺病毒感染后照射对U251生长的影响； 图10是实施例中重组腺病毒对U251细胞周期的影响； 图11实施例中重组腺病毒感染后照射对U251细胞凋亡的影响。具体实施例方式下面结合附图及实施例对本专利技术作进ー步描述 实施例 一.构建DCX和SPARC双基因共表达重组腺病毒载体 技术流程1、针对DCX和SPARC设计引物(表1)，在DCX两端分别引入BglII和KpnI酶切位点，SPARC两端分别引入NotI和XhoI酶切位点。以人cDNA文库为模板，在Phusion高保真DNA聚合酶的作用下扩增得到DCX和SPARC的目的片段，并进行琼脂糖电泳鉴定。表I. PCR 引物 細通For GCAAGATCTATGMMCACTCOCCCTTC Dd - 8ct TMGGTAGLTTACATGGAATCACCAAGCG SPARC For TMGCGGODGCATCAGGGOCTGGATOTRct : TAGCrCKA&raCATaOAGATOCTTCT 2、双酶切目的基因PCR产物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空载体转移质粒，用T4DNA连接酶将其4°C连接过夜(连接方式见图I)。连接产物转化DH5a大肠杆菌，用LB琼脂平板(含50 μ g/ml卡那霉素)筛选抗性克隆。在DNA序列測定后，将阳性克隆保种备用。构建的单、双基因重组转移质粒载体为pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter,pAdTrack-CMV-poIyA+promoter-SPARC, pAdTrack-DCX-poIyA-promoter-SPARC。3、将构建的单、双基因重组转移质粒用PmeI单酶切线性化后，与pAdEasy-Ι腺病毒骨架质粒共转化BJ5183大肠杆菌，用LB琼脂平板(含50 μ g/ml卡那霉素)筛选抗性克隆。用PacI单酶切鉴定并转化DH5a大肠杆菌。4、将成功本文档来自技高网...

【技术保护点】
DCX和SPARC双基因共表达载体在制备放疗增敏剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.DCX和SPARC双基因共表达载体在制备放疗增敏剂中的应用。2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于通过构建DCX和SPARC双基因共表达重组腺病毒载体实现。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述重组腺病毒载体的构建方法是 (1)针对DCX和SPARC基因序列，制备PCR引物，所述PCR引物由DCX 正义引物 GCAAGATCTATGAAAACACTCCCCCTTC、DCX 反义引物 TAAGGTACCTTACATGGAATCACCAAGCG、SPARC 正义引物 TAAGCGGCCGCATGAGGGCCTGGATCTT 和 SPARC 反义引物 TAGCTCGAGTTAGATCACAAGATCCTTGT 构成，在 DCX 两端分别引入 BglII 和KpnI酶切位点，SPARC两端分别引入NotI和XhoI酶切位点，扩增得到DCX和SPARC目的片段； (2)双酶切目的基因PCR产物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘芬菊，徐媛媛，蒋昕，俞家华，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：