预防艾滋病的核酸疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种预防艾滋病的核酸疫苗，所述疫苗为含有编码人类免疫缺陷病毒－１（ＨＩＶ－１）结构蛋白的经过人工修饰的Ｇａｇ、Ｐｏｌ和Ｅｎｖ核苷酸序列的重组核酸。这些疫苗在体内施用时用作病毒蛋白抗原生物合成的转录单位。本发明专利技术的优点及有益效果：（１）改进ＤＮＡ疫苗生产工艺，力图扩大ＤＮＡ疫苗产量，降低生产成本；（２）为确保安全性，我们在动物模型上进行了该ＤＮＡ疫苗在多种器官和组织的分布，持续时间和整合试验，结果显示没有任何可检测到的整合的迹象；（３）疫苗靶抗原包括了几乎所有的ＨＩＶ－１结构蛋白，如ＧａｇＰｏｌ和Ｅｎｖ，更好的诱导人体产生对ＨＩＶ有效的免疫保护。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的疫苗，尤其是，所述疫苗为含有编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白的经过人工修饰的Gag、Pol和Env核苷酸序列的重组核酸。这些疫苗在体内施用时用作病毒蛋白抗原生物合成的转录单位。
技术介绍
艾滋病被认为是世界上直接威胁人类健康的第一大传染病，联合国艾滋病联合规划署发表的《2004全球艾滋病疫情年度报告》指出，目前全球有3800万名艾滋病病毒携带者，2003年共有290万人死于艾滋病。2003年，亚洲地区共有110万人被感染，50多万人死于艾滋病，该地区目前共有740万名艾滋病毒携带者。2003年底，中国有艾滋病病毒感染者约84万，其中艾滋病患者约8万例。报告感染数波及31个省、自治区、直辖市。虽然近几年抗艾滋病药物的“鸡尾酒”疗法在发达国家有效地控制了HIV的蔓延，但是昂贵的价格(在我国该药物价格大约为3000-10000元人民币/人/月)，耐药病毒株的产生，长期用药的副作用以及最终无法彻底清除患者体内病毒等方面的不利因素显示，只有艾滋病疫苗才能真正有效地预防和控制艾滋病。国内外有关方面研究现状 用HIV-1疫苗防治AIDS被国际上认为是目前最行之有效的方法，已成为世界上许多科研机构研究的热点。目前，关于艾滋病疫苗的生产国际上尚属空白。而HIV-1疫苗的研制工作在国外已有多家大型科研机构、制药公司正开展进行。自八十年代发现艾滋病以来，人们就开始进行艾滋病疫苗的研究。一般来说，减毒活疫苗和灭活疫苗能产生较好免疫保护性反应，但安全性较差，不适用于作为艾滋病疫苗。随着人类对艾滋病认识的不断提高，九十年代初人们意识到CTL(Cytotoxic T Lymphocytes细胞毒性T细胞，即细胞免疫应答)的重要性，越来越多的证据显示阳性CD8介导的CTL在控制艾滋病毒感染中起举足轻重的作用。因此人们开始研究用重组病毒载体疫苗来诱导CTL，然后用胞膜蛋白亚单位疫苗增强免疫来诱导中和抗体，力图从体液免疫和细胞免疫两方面来诱导人体对艾滋病毒的保护反应。但由于免疫强度有限，而用重组载体疫苗又难以进行多次增强免疫，所以在动物模型和人体试验结果都显示了较低的对HIV的免疫保护反应。安全有效的诱导CTL的方法为DNA疫苗和以重组痘病毒为典型代表的重组病毒疫苗。九十年代后期，DNA疫苗被广泛用于艾滋病疫苗的研究。它通过抗原在细胞内表达，而产生细胞和体液免疫反应。DNA疫苗像减毒活疫苗那样即诱导体液免疫又诱导细胞免疫，但是又不似后者那样具有很大的潜在危机。Wang及其同事报道，以HIV/Z6 gp160和Rev为抗原所构建的DNA疫苗在小鼠和猴子体内产生了良好的细胞免疫和体液免疫。这是由于DNA疫苗有抗原纯，可多次重复免疫以及能诱导高效价记忆性CTL的特点。目前人们采用多次DNA疫苗免疫后，再用高效表达靶抗原的病毒载体疫苗来增强免疫的方案，以期诱导更强的免疫反应，达到使人体产生对HIV有效的免疫保护的效果。美国、法国、意大利、澳大利亚等多个研究小组已经在肯尼亚、乌干达、美国、法国、意大利、澳大利亚等多个国家和地区开展了数项艾滋病疫苗的临床研究。国内研究艾滋病疫苗的队伍主要有中国预防医学科学院、卫生部艾滋病预防与控制中心和病毒学研究所、清华大学、中国科学院微生物所及一些部队院校等。
技术实现思路
本专利技术提供一种预防艾滋病的核酸疫苗。该核酸疫苗是含有转录单位的人工合成的核酸序列，所述转录单位编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白序列，该人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白序列是具有免疫原性的人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)抗原，其中转录单位指导该抗原的合成。本专利技术的一个重要方面，所含有的转录单位编码的是人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重组型的结构蛋白。进一步包括人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的完整核心蛋白Gag、编码酶类蛋白Pol和外膜蛋白Env。在本专利技术的重要实施方案中，其中编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白Gag、Pol和Env的核苷酸序列来源于经过人工修饰的编码野生型中国流行株人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重组型的结构蛋白的核苷酸序列，其编码Gag和Pol的核苷酸序列为SEQ ID NO2、编码Env的核苷酸序列为SEQ ID NO3。本专利技术的另一个重要方面，本核酸序列是脱氧核糖核酸DNA。在另一个重要实施方案中，该含有转录单位的人工合成的核酸序列，包含两个巨细胞病毒早期启动子CMV，一个控制GagPol的表达，另一个控制Env蛋白的表达，含有由原核启动子驱动的抗卡那霉素基因和用于扩增DNA质粒所需的原核细胞高拷贝因子，它含有内含子A和牛生长激素多聚腺苷酸加尾终止信号BGH polyA。本专利技术的重要实施方式中其核苷酸序列如SEQ ID NO1所述。此外，本专利技术提供了免疫接种受试者抗艾滋病感染的组合物，其中包括含有人类免疫缺陷病毒-1抗原转录单位的人工合成的核酸序列和一种可药用的载体。该转录单位在受试者体内细胞中指导该细胞合成抗原。该组合物中可药用的载体可为生理盐水。此外抗原可以为人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白Gag、Pol和Env。药用组合物，质粒D-GPEi与生理盐水的重量体积比为1.0～4.0mg/ml，优选2mg/ml每次注射2ml，共注射3次。本专利技术的优点及有益效果(1)改进DNA疫苗生产工艺，力图扩大DNA疫苗产量，降低生产成本；(2)为确保安全性，我们在动物模型上进行了该DNA疫苗在多种器官和组织的分布，持续时间和整合试验，结果显示没有任何可检测到的整合的迹象；(3)疫苗靶抗原包括了几乎所有的HIV-1结构蛋白，如GagPol和Env，更好的诱导人体产生对HIV有效的免疫保护。附图说明图1、HIV-1基因组示意图。其中Gag，Pol和Env是最主要的结构基因。图2、D-GPEi核酸疫苗质粒构建过程示意图。图3、HIV-1中国流行株的gagpol和env基因在哺乳动物细胞中的表达。人HEK293细胞被含D-GPEi疫苗转染。蛋白表达用WESTERN BLOT分析。LANE1是空白对照(以未被D-GPEi疫苗转染的HEK293细胞为空白对照)；LANE2是表达样品；A图采用HIV-1 P24蛋白单克隆抗体作为检测抗体，由于该抗体只识别Gag、GagPol蛋白，因此，该免疫印迹实验图中只显现出Gag、GagPol两种蛋白。B图采用HIV-1中国流行株阳性人血清作为检测抗体，由于该抗血清中含有抗Gag和Env抗体，因此，该免疫印迹实验图中显现出Gag、GagPol和Env三种蛋白。C图采用抗gp120羊抗血清作为检测抗体，由于该抗体只识别Env蛋白，因此，该免疫印迹实验图中只显现出Env蛋白。图4、D-GPEi在哺乳动物细胞中的表达。人HEK293细胞被D-GPEi质粒转染。蛋白表达用WESTERN BLOT分析。实验所用抗体为广西壮族自治区HIV-1阳性血清。LANE1空白对照；LANE2D-GPEi表达产物；LANE3标准病毒(广西壮族自治区HIV-1高发区病毒样品)。具体实施例方式实施例1抗原的选择与修饰1、目的基因的选择目前中国主要的HIV-1流行株为B/C重组型HIV-1。选择的HIV-1中国流行株gagpo本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有转录单位的人工合成的核酸序列，所述转录单位编码人类免疫缺陷病毒－１（ＨＩＶ－１）结构蛋白序列，该人类免疫缺陷病毒－１（ＨＩＶ－１）结构蛋白序列是具有免疫原性的人类免疫缺陷病毒－１（ＨＩＶ－１）抗原，其中转录单位指导该抗原的合成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孔维，于晓方，田春娟，刘滨东，
申请(专利权)人：长春百克药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]