增强的病毒介导的DNA转移制造技术

一种通过逆病毒提高造血细胞和其它细胞转导效率的方法，其包括在纤维结合素或纤维结合素片段存在的条件下感染细胞。如图所示，纤维结合素或纤维结合素片段显著地增强了逆病毒介导的向细胞（特别是造血细胞，包括定型祖细胞和初级造血干细胞）中进行的基因转移。本发明专利技术还提供了利用增强的基因转移法、造血细胞类群和新的用于增强向细胞中进行逆病毒介导的ＤＮＡ转移的构建体而进行的改进的体基因疗法及其应用。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及通过病毒提高细胞转导效率的方法，具体地说，涉及用纤维结合素和/或纤维结合素片段来增强病毒介导的基因向细胞转移的方法。
技术介绍
近来，随着人们对许多人类疾病分子基础的了解以及基因转移技术的发展，人们开始尝试建立对一些遗传病的体基因疗法(somatic genetherapy)方案。目前用基因疗法有希望治愈的疾病有这样一些在这些疾病中，一种酶或其他蛋白有缺陷或者丢失，而这些酶或蛋白的水平不需精确调节，尤其不需内在的精确调节，而且那些酶或蛋白的缺陷是在患者骨髓中可发现的。例如，一种可用基因疗法来治疗的疾病是腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症。这种病会导致严重的并发免疫缺乏症(SCID)。ADA缺乏的患者骨髓中有很少或没有这种酶。然而，ADA缺乏已通过相配的骨髓移植得到治疗。ADA正常的细胞对ADA缺乏的细胞有一种选择优势，并且会再生出病人的骨髓。骨髓细胞之所以是体基因疗法的好的目标，是因为骨髓组织易于体外操作并且包含可再生细胞。另外，人脐带血中也包含大量的始祖细胞。把基因成功地转入可长期再生的造血干细胞中，这些细胞的后代的存在使得多种疾病得以终身治愈。一些研究者已在鼠中将基因转移至可再生干细胞中并在可再生干细胞中长期表达。然而对于大型动物，如狗和灵长类，体内实验还仅有极少的成功记录。这很可能是由于初级造血干细胞的感染效率较低的缘故。当应用于人类时，现有的基因转移技术的局限性就更加复杂了，这是由于以下因素的存在造成的成人骨髓(ABM)中干细胞较少；缺乏纯化这些细胞的方法；并且这种原始细胞在细胞周期中所占的时间相对较少。在鼠和大型动物的骨髓细胞实验中，人们注意到，最成功的方案是把靶细胞与产生逆病毒的细胞系共同培养。另外，多数的FDA支持的基因转移试验依赖于重组的逆病毒载体来进行基因转导。由于重组逆病毒载体转移效率高并且可以精确而稳定地把外源DNA整合到细胞DNA中，所以它成为基因疗法很合适的载体。这些载体中包含所要转移的外源DNA，并经过进一步的修饰除去了病毒的病原性。由于这些修饰，病毒的产生就通过逆病毒包装细胞而基本上完成了。然而，对于临床基因疗法，由于考虑到生物安全性和质量控制，不依赖细胞的转导更为合适。不幸的是，如果不与产生病毒的细胞共同培养，一般很难把基因有效地转移到造血细胞比如干细胞中。最近，有人指出，在感染过程中，把靶细胞暴露于基质细胞中，基因转移效率会被提高。基质细胞是造血微环境(HM)的一种主要成分。HM由一种有组织的网络组成，主要包括巨噬细胞、基质细胞、内皮细胞、脂肪细胞和一类由多种特定粘附分子组成的复合胞外基质(ECM)。一些ECM分子，如laminin，胶原，thrombospondin，蛋白多糖，葡糖胺多糖和纤维结合素，为造血细胞和生长因子提供了锚定位点。基质使逆病毒感染效率提高的机制还不清楚，但一段时间以来，人们已经知道，当造血细胞与HM的细胞直接接触时，会对这些造血细胞增殖和分化有生理调节作用。要把基因有效地转入可长期再生的造血干细胞及其他细胞之中还存在一些疑问，这就使基因转移法在对造血病或其他病的治疗方面受到了限制。人们需要一种方法，它可以有效地把遗传物质转入哺乳动物体内，并且不带有过去方法所具有的危险性和局限性。本专利技术中的方法满足了这些需求。专利技术概述简单地说，本专利技术的一个优选实施方案提供了一种通过逆病毒载体来提高造血细胞转导频率的方法。这种方法包括在可通过逆病毒来有效地提高细胞转导频率的纯的纤维结合素和/或纤维结合素片段存在的条件下，用一种缺乏复制能力的重组逆病毒载体来感染活的造血细胞。这些纤维结合素和/或纤维结合素片段可以从天然材料中获得，或通过合成而得到(例如，用重组或化学合成基因工程技术进行)，也可以通过天然与合成材料相结合而获得。另外，应该明白，本专利技术中所用的纤维结合素多肽可能包括对天然纤维结合素氨基酸序列的一些突变，从而为本专利技术提供了对提高转导效率有促进作用的具有粘附的功能多肽。本专利技术的另一个优选实施方案提供了一种制备被被转导的造血细胞的方法。此方法包括用一种复制缺损型的带有外源DNA的重组逆病毒来感染活的造血细胞。此方法中要有足够的固定化的纤维结合素或其片段或者它们的固定化混合物，从而能够有效地通过逆病毒来提高细胞转导频率。本专利技术的另一个优选实施方案提供了一种细胞移植的改进方法。这一方法包括从动物供体中获得活的造血细胞；在固定化的纤维结合素和/或它的片段存在并可有效地提高转导频率的条件下，用重组的逆病毒载体感染造血细胞来制备被转导的活的造血细胞；并且把这种被转导的活的造血细胞作为细胞移植体导入到动物受试者体内。在一个优选方式中，这些被感染的细胞能被导入到自身供体中。本专利技术的另一个优选实施方案提供了一种可获得适合于细胞移植过程的被转导的脐带血细胞的方法。这种方法包括在存在可通过逆病毒提高造血细胞转导频率的有效固定化量的纤维结合素和/或纤维结合素片段的情况下，用复制缺损型的重组逆病毒载体来感染脐带血中的造血细胞。本专利技术还包括用这种方法获得的从脐带血中得到的活的被转导细胞类群；以及把被转导的细胞类群作为移植体导入动物体内的移植方法。根据上述各实施方案中更特殊的方面，所用的纤维结合素或纤维结合素片段将包括提供了纤维结合素的肝素-II结合区逆病毒结合活性的第一氨基酸序列，也包括提供了纤维结合素的CS-1区细胞结合活性的第二氨基酸序列。把纤维结合素的这两个结合区同时使用被证明可以非常明显地通过逆病毒提高靶细胞的转导效率。本专利技术的另一个优选实施方案提供了一种制备通过逆病毒载体来提高指定靶细胞转导效率的构建体的方法。本方法包括把靶细胞上结合的配体，与纤维结合素上提供了逆病毒结合活性的肝素II结合区序列的多肽共价偶联的步骤。本专利技术还包括利用这些构建体通过逆病毒来增加指定靶细胞转导效率的方法，以及用这些被转导的细胞进行移植的过程。本专利技术的另一个优选实施方案提供了一种定位多种病毒的方法。此方法包括，在足够的固定化的纤维结合素或纤维结合素片段存在下，温育含有该病毒的培养基，其中纤维结合素或纤维结合素片段中具有肝素II结合区域的病毒结合活性，可用来定位多种病毒。本专利技术还有一个优选的实施方案，它提供了被转导的活的造血细胞及含有基本上纯的和/或固定化的纤维结合素或其片段的细胞培养物。同时还提供了逆病毒介导的DNA向细胞转移的试剂盒。这将在后面进一步说明。本专利技术的一个目的是提供利用逆病毒有效地感染哺乳动物细胞的方法。本专利技术的另一个目的是提供利用逆病毒载体进行基因转移的方法。本专利技术的另一个目的是提供一些用于自体和/或异体细胞移植的改进的移植方法和细胞培养物。本专利技术的这些及其他目的、优点、特性经过阅读下面的说明书之后，对那些熟悉本领域的人来说将是非常明显的。 附图说明图1.给出了包括胰凝乳蛋白酶片段的纤维结合素分子的简图。图2.显示了存在纤维结合素片段时TKNEO载体使人的始祖细胞被感染的效率。在以后的实施例1中将进一步描述。图3.比较了在纤维结合素片段存在时用TKNEO载体使各种人的造血始祖细胞被感染的效率。在以后的实施例1中将进一步描述。图4.比较了用不同方法转导的骨髓细胞移植到小鼠体内之后，hADA的存在情况。(i)泳道2-4用的是共同培养法，(ii)泳道5-7是在固定化的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过复制缺陷型重组逆病毒载体提高活的造血细胞转导频率的方法，此方法包括在存在纤维结合素片段的条件下，用复制缺陷型重组逆病毒载体来感染活的造血细胞，从而通过复制缺陷型逆病毒载体提高活的造血细胞转导频率，所述纤维结合素片段由细胞结合区、肝素Ⅱ结合区和纤维结合素的ＣＳ－１区组成。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：DA威廉斯，VP帕特尔，
申请(专利权)人：印第安纳大学研究及科技有限公司，西北大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]