本发明专利技术涉及一种检测发热伴血小板减少综合征新布尼亚病毒抗原酶联免疫吸附试验试剂盒的制备和应用。试剂盒采用发热伴血小板减少综合征病毒，简称新布尼亚病毒JS-2007-001病毒株免疫家兔和小鼠获得抗血清。用兔抗体包被酶联反应板，小鼠抗体偶联辣根过氧化物酶(HRP)配以抗原定量参考品，酶底物TMB?显色剂等辅助试剂组成试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
—种检测新布尼亚病毒抗原的ELISA试剂盒的制备和应用1.专利
本专利技术属于生物
免疫诊断范畴。根据靶标分类的不同，目前针对传染病的诊断可分为分子生物学和免疫学诊断两类。分子生物学诊断具有快速、检出限低等优点，但是对于尖端仪器的依赖、易交叉污染以及对操作人员高素质的要求等，限制了其在基层的应用和推广。免疫学诊断(亦称血清学诊断)是以抗原抗体之间特异性结合为基础，如可以通过病原体特异性抗原检测其抗体，反之亦然。传统的免疫学诊断方法包括如病毒微量中和、免疫荧光、空斑减少等，但上述实验均涉及时间过长、需要操作活病毒、只能在高等级实验室内进行等问题。与上述各类实验方法相比，基于酶联免疫吸附试验ELISA原理开发的诊断试剂，具有敏感性高特异性强、操作简便、节约时间、价格低廉和适合基层使用等优点，市场的需求量也较大。2.专利技术背景 新布尼亚病毒(Novel Bunyavirus, SFTS Bunyavirus),是发热伴血小板减少综合症(Feverwith Throbocytopenia Associated Syndrome, SFTS)的病原，为布尼亚病毒科白蛉热病毒属的一种新型病毒，于2009年在中国首先发现，也是中国首例发现的新型病毒。患者出现以高热、血小板减少、白血球降低、多器官功能紊乱、出血等为特征的严重急性传染病，严重影响着人民的健康和生命安全。2010年中国中东部，包括安徽、江苏、湖北、河南、山东等省先后爆发多起由蜱虫叮咬而致人死亡公共卫生事件，造成社会恐慌，严重影响当地群众健康安全和经济发展。到目前为止，国内16个省发现300多病例，造成40余人死亡。经国家疾控中心、相关省疾控中心多家单位的联合攻关，现已查明引起该传染病的病原为一新型的出血热病毒，在分类学上属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、白令病毒属(Phlebovirus genus),目前命名为发热伴血小板减少综合征病毒(Severe Febrile andThrombocytopenicyndrome Virus, SFTSV)目前该病毒序列已经阐明，基于RT-PCR的检测标准已经建立，但是对SFTSV的免疫学检测试剂还未建立，使得评价该病毒感染缺乏一个对PCR结果的验证方法。也无法评估群体的既往感染水平以及疫苗的保护作用。由于该病毒引起的是一新发传染病，临床始发症状与普通流感无异，且病人多集中在卫生医疗水平薄弱的农村地区；同时基层医疗从业人员缺乏相关鉴别诊断的培训，当前迫切需要能适应基层临床检验人员操作的、快速检测方法，便于对病人的及时救治。另夕卜，该病的流行病学特征、传播媒介、动物感染情况等目前均处于空白状态，也急需开发操作简单、方便快捷的检测试剂，以满足疾控系统对疫区人群、动物监测工作之需求，而目前市场无相关产品供应。3.
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供了一株新的，用于检测发热伴血小板减少综合征病毒的新布尼亚病毒JS-2007-001,该病毒分类命名为新布尼亚病毒(Severe feverwiththrombocytopenia syndrome virus ；Novel Bunyaviridae),其保藏号为 CCTCC V201211 ；保减时间为2012年3月I日；保减单位为中国典型培养物保减中心；保减地址为武汉大学生命科学学院武汉市武昌珞珈山。本专利技术的目的之二在于提供了利用上述新布尼亚病毒JS-2007-001制备检测发热伴血小板减少综合征病毒抗原的ELISA试剂盒。本专利技术的优点在于，经过适应性培养、免疫原性鉴定和免疫保护作用鉴定发现，本专利技术中分离的JS-2007-001病毒毒种具有最佳的生长特性和适应特性，在较短时间内达到生长高峰，可稳定获得较高滴度病毒，免疫动物获得抗体水平较高，从而能开发成为一种稳定的可商业化应用的检测发热伴血小板减少综合征病毒的试剂盒。本专利技术涉及一种制备用于检测新布尼亚病毒抗原的ELISA试剂盒的制备方法，其包括如下步骤将经细胞培养获得的该保藏号为CCTCCV201211的新布尼亚病毒JS-2007-001原液经灭活超滤浓缩后，分别用超速离心法和柱层析法进行 纯化得到纯病毒抗原；用病毒抗原分别免疫家兔和小鼠获得特异性抗血清，再经柱层析纯化获得特异性纯抗体，将免疫获得的兔抗新布尼业病毒JS-2007-001抗体作为第一抗体包被酶联反应板；将免疫获得的小鼠抗新布尼亚病毒JS-2007-001抗体偶联辣根过氧化物酶HRP作为检测报告抗体；用灭活后的新布尼亚病毒JS-2007-001质控参考品；检测样本如果含有新布尼亚病毒，则会结合于所述的兔抗新布尼亚病毒JS-2007-001抗体包被的反应板，继而被HRP标记的小鼠抗新布尼亚病毒JS-2007-001抗体识别结合，构成抗体-抗原-抗体双抗体夹心检测系统，TMB显色结果。按照本专利技术所述的方法制备得到的试剂盒，其能检测新布尼亚病毒特异性抗原的滴度范围为Ing/mL。按照本专利技术所述的方法制备得到的试剂盒在制备用于新布尼病毒的检测的诊断试剂中的应用。按照本专利技术所述的方法制备得到的试剂盒在制备用于人群感染情况评估和疫苗制备中抗原含量的检测和疫苗效果观察结果的评价的诊断试剂中的应用。按照本专利技术所述的方法制备得到的试剂盒，可以用于新布尼亚病毒早期感染的检测，也可以用于新布尼亚病毒感染情况的流行病学调查的评价以及新布尼亚病毒灭活疫苗中抗原含量的测定和疫苗免疫效果的评价。试剂盒的主要质量指标为试剂质量指标达到2010版《中国药典》第三部，体外诊断类规程中的要求。其中包括灵敏性、特异性、精密性、稳定性、总符合率。按照本专利技术所述的方法制备得到的试剂盒的检测灵敏度为不高于Ing/mL ;特异性验证与其它同科布尼亚病毒无交叉反应；精密性验证试剂批间差异(cv% )应不高于15% ;其样品检测阳性率与RT-PCR检出总符合率彡95%。4.附图说明图I为新布尼病毒抗原ELISA检测试剂盒制备流程图5.具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术做进一步说明。本实施例权权用于对本专利技术的说明，不构成对本专利技术的限制。实施例I :新布尼亚病毒(JS-2007-001病毒株)免疫家兔以及血清抗体制备7株新布尼亚病毒株分别分尚自江苏和安徽疫区，6株直接分尚于病人血清，I株来源于可疑病犬。分离时所有细胞为VERO细胞(表I)。表I :7株新布尼亚病毒株的分离时间与来源 分离时间分离沾'份分离称本分离时Iti细胞JS-2007-0012011-04-01一江苏 Χ ι .淸Vero JS-2010-0042010-06-13^病人血.消JS-2010-014~^010-10-11一江苏血淸VeroJS-2010-0182010-11-265 病人血.渚 JS-2010-0262010-11-22UJj病人血淸Veii0 JS-2010-DOG2011-01-14可疑病犬Vero ____M__~~JS-2011-013 2011-06-15 江苏病人血淸Vero7株新布尼亚病毒株在VERO细胞做适应性培养、免疫原性鉴定和免疫保护作用鉴定发现，JS-2007-001病毒毒种具有最佳的生长特性和适应特性，在较短时间内达到生长高峰，可稳定获得较高滴度病毒，免疫动物获本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备用于检测新布尼亚病毒抗原的ELISA试剂盒的制备方法，其包括如下步骤：将经细胞培养获得的该保藏号为CCTCC？V201211的新布尼亚病毒JS？2007？001原液经灭活超滤浓缩后，分别用超速离心法和柱层析法进行纯化得到纯病毒抗原；用病毒抗原分别免疫家兔和小鼠获得特异性抗血清，再经柱层析纯化获得特异性纯抗体，将免疫获得的兔抗新布尼亚病毒JS？2007？001抗体作为第一抗体包被酶联反应板；将免疫获得的小鼠抗新布尼亚病毒JS？2007？001抗体偶联辣根过氧化物酶HRP作为检测报告抗体；用灭活后的新布尼亚病毒JS？2007？001质控参考品；检测样本如果含有新布尼亚病毒，则会结合于所述的兔抗新布尼亚病毒JS？2007？001抗体包被的反应板，继而被HRP标记的小鼠抗新布尼亚病毒JS？2007？001抗体识别结合，构成抗体？抗原？抗体双抗体夹心检测系统，TMB显色结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：万里明，焦永军，曾晓燕，
申请(专利权)人：万里明，
类型：发明
国别省市：
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