本发明专利技术公开了属于环境工程技术领域的一种生物活性炭上微生物DNA提取预处理方法。此方法采用浓度为200mM的NaOH和2.0wt%的聚乙烯吡咯烷酮混合溶液作为脱腐缓冲液对活性炭进行脱腐处理，超声波洗脱1min和然后化学裂解后提取生物活性炭上的微生物DNA。所获总DNA长度在20Kb以上，完全满足PCR分析的要求。解决了生物活性炭上因生物量少且和载体颗粒结合紧密导致的洗脱困难问题，减少了腐殖酸对微生物核酸提取的不利影响，微生物细胞充分裂解。该方法操作简便，DNA产量大，纯度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于环境工程
，具体涉及一种生物活性炭上微生物DNA提取预处理方法。
技术介绍
活性炭由于具有良好的吸附性能，化学性能稳定，可耐强酸及强碱，能经受水浸、高温、比水还轻，是多孔性的疏水性吸附剂，故已广泛用于去除饮用水中的臭味、色度、天然及人工合成有机物。活性炭上附着的以微生物及其胞外多聚物为主体的生物膜是水体中有害物质生物降解的主要部分。因此鉴定分析活性炭表面微生物群落结构和分布对于明确饮用水深度处理中活性炭生物降解机制以及微生物泄露导致的健康风险具有重要意义。 传统的微生物检测是建立在微生物的分离培养基础上的，检测周期长，操作复杂，特异性不强。同时环境中的大量微生物无法实现人工培养，或者在培养过程中由于生存环境的改变而改变原有的群落结构，因此仅靠现有的微生物培养技术不能全面地反映所在环境的微生物多样性。分子生物学技术于是成为了研究生物活性炭微生物群落的主要手段。然而，由于处理饮用水的生物活性炭上的生物量相对少，并且和载体颗粒结合紧密，所以菌体很难直接从活性炭上洗脱下来。另一方面，活性炭上吸附的腐殖酸在自然条件下不易发生生物降解，又表现出极性、氧化还原性、络合与吸附等多重理化性质，在经典的DNA提取过程中与粘粒及金属离子等相互作用而将微生物裹挟其中，阻止SDS等变性剂的渗透并抑制溶菌酶及蛋白酶K等的活性，影响裂解缓冲液对微生物的裂解。同时经碱性裂解液处理后溶出的黄腐酸与棕腐酸既能氧化为醌，又能还原为酚，会导致部分DNA随氧化的苯酚进入有机相而丧失。即使采用透析、离子交换、密度梯度离心、层析和电泳等不同方法对核酸粗提物进行进一步纯化，仍有一些理化性质与核酸相近的腐殖酸组分与之共存，从而影响到核酸的定量及后续的PCR扩增等技术过程。然而，传统的DNA提取和市售DNA提取试剂盒都不能有效解决上述问题，因此如何在裂解细胞前采用去除腐植酸的预处理和有效微生物洗脱方法就成为从生物活性炭上获得产量大质量高的DNA的关键。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种生物活性炭上微生物DNA提取预处理方法，以获得产量和纯度均达到适用于下游分子生物学操作的DNA片段。一种生物活性炭上微生物DNA提取预处理方法，该方法包括步骤如下(I)生物活性炭的脱腐将生物活性炭与脱腐缓冲液按质量/体积比I : 10混合，旋润2min后，在50°C下反应IOmin,再旋润2min后，在转速为I. OX IO4 rpm下离心5min ;其中脱腐缓冲液为NaOH浓度为200mM、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)浓度为2. Owt%的混合溶液；(2)超声洗脱取上述离心后的活性炭，溶于灭菌的去离子水中，旋涡2min后常温下水浴20min，进行Imin超声处理，然后取超声后悬浊液，进行DNA提取纯化。本专利技术的有益效果为以浓度为200mM的NaOH和浓度为2. 0wt%的PVP作为脱腐缓冲液脱腐能力高，减少了腐殖酸对微生物核酸提取的不利影响；超声洗脱处理活性炭克服了饮用水生物活性炭上因生物量少且和载体颗粒结合紧密导致的洗脱困难；本专利技术克服了传统直接提取DNA方法的缺陷，且操作简单，能够从生物活性炭上获得高产量且高纯度的 DNA。附图说明图I为实施例I中9种不同方法提取总DNA电泳图；其中各标号条带分别为1-λ-Hind III digest DNA Marker, 2-4分别为NaOH+PVP混合溶液脱腐并超声处理l、2、5min，5-7分别为NaOH溶液脱腐并超声处理I、2、5min，8-10分别为不脱腐并超声处理l、2、5min。 图2为实施例2中9种不同方法提取获得的总的DNA的PCR电泳图；其中各标号条带分别为1-M100 bp DNA Ladder，2-4分别为NaOH+PVP混合溶液脱腐并超声处理l、2、5min，5-7分别为NaOH溶液脱腐并超声处理l、2、5min，8_10分别为不脱腐并超声处理l、2、5min。具体实施例方式下面将通过具体实施例和附图对本专利技术做进一步说明。实施例I :比较不同脱腐缓冲液脱腐效果生物活性炭样品取自北京市某自来水厂。脱腐缓冲液分别采用不同浓度单一组分的浓度分别为50mM、100mM、200mM的NaCl溶液，浓度分别为50mM、100mM、200mM的Tris-HCl溶液，浓度分别为50mM、IOOmM,200mM的NaOH溶液和不同浓度的NaOH+PVP混合溶液，浓度组合分别为50mM+0. 5wt%、100mM+l. 0wt%、200mM+2. 0wt%对活性炭中腐殖酸进行去除。脱腐效果如表I所示。单一组分的脱腐缓冲液中，如NaCl溶液和Tris-HCl在脱腐处理后上清颜色没有变化，说明二者均不具备明显的脱腐能力，NaOH溶液浓度大于IOOmM时上清淡棕色，说明IOOmM以上的NaOH溶液表现出一定的脱腐效果；将不同配位剂加以组合其脱腐效果可得到提高，在本实例中组合后的脱腐缓冲液的脱腐能力大大提高，特别是经200mM的NaOH和2. 0%的PVP的脱腐缓冲液处理后上清变为深棕色，说明选择以200mM的NaOH和2. 0%的PVP作为脱腐缓冲液可以有效去除腐殖酸。表I不同脱腐缓冲液的脱腐效果权利要求1.一种生物活性炭上微生物DNA提取预处理方法，其特征在于，该方法包括步骤如下 (1)生物活性炭的脱腐将生物活性炭与脱腐缓冲液按质量/体积比I: 10混合，旋润2min后,在50°C下反应IOmin,再旋润2min后,在转速为I. 0 X IO4 rpm下离心5min;其中脱腐缓冲液为NaOH浓度为200mM、聚乙烯吡咯烷酮浓度为2. Owt%的混合溶液； (2)超声洗脱取上述离心后的活性炭，溶于灭菌的去离子水中，旋涡2min后常温下水浴20min，进行Imin超声处理，然后取超声后悬浊液，进行DNA提取纯化。全文摘要本专利技术公开了属于环境工程
的一种生物活性炭上微生物DNA提取预处理方法。此方法采用浓度为200mM的NaOH和2.0wt%的聚乙烯吡咯烷酮混合溶液作为脱腐缓冲液对活性炭进行脱腐处理，超声波洗脱1min和然后化学裂解后提取生物活性炭上的微生物DNA。所获总DNA长度在20Kb以上，完全满足PCR分析的要求。解决了生物活性炭上因生物量少且和载体颗粒结合紧密导致的洗脱困难问题，减少了腐殖酸对微生物核酸提取的不利影响，微生物细胞充分裂解。该方法操作简便，DNA产量大，纯度高。文档编号C12N15/10GK102807979SQ201210300669公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月22日 优先权日2012年8月22日专利技术者刘文君, 张明露, 王占朝 申请人:清华大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生物活性炭上微生物DNA提取预处理方法，其特征在于，该方法包括步骤如下：（1）生物活性炭的脱腐：将生物活性炭与脱腐缓冲液按质量/体积比1？:？10？混合，旋涡2min？后，在50℃下反应10min，再旋涡2min？后，在转速为1.0×104？rpm下离心5min；其中脱腐缓冲液为NaOH浓度为200mM、聚乙烯吡咯烷酮浓度为2.0wt%的混合溶液；（2）超声洗脱：取上述离心后的活性炭，溶于灭菌的去离子水中，旋涡2min后常温下水浴20min，进行1min超声处理，然后取超声后悬浊液，进行DNA提取纯化。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘文君，张明露，王占朝，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：
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