一种活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白的方法技术

本发明专利技术提供一种活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白的方法，包含如下步骤：A.将蓝藻进行破壁以产生藻液；B.将所述藻液进行固液分离，然后将所得液体进行离心，之后取上清液，以获得藻蓝蛋白粗提液；C.向上述藻蓝蛋白粗提液中加入适量活性炭，搅拌并静置后离心，再次获得上清液；D.向步骤C中获得的上清液中加入硫酸铵，搅拌并静置后离心，第三次获得上清液；E.向步骤D中获得的上清液中追加适量硫酸铵，搅拌并静置后离心，获得沉淀，将沉淀用磷酸缓冲液溶解，获得藻蓝蛋白溶液。本方法与传统多步盐析法相比，在达到药品级纯度＞3.0的要求并兼顾蛋白质回收率的前提下，省去了近三分之一的操作，节省了时间和成本，提高了效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生化分离纯化
，特别是涉及一种藻蓝蛋白的分离纯化方法。
技术介绍
蓝藻是一类微小的原核生物，伴随着富营养化会大量生长形成水华，危害水体水质。其中在夏天由水温升高形成的水华主要为铜绿微囊藻。目前有关水华蓝藻的资源化利用主要集中在两方面：堆肥处理和蓝藻中有效物质提取。藻蓝蛋白是一种普遍存在于蓝藻细胞中的捕光色素蛋白，其基本组成单位是α亚基和β亚基，亚基分子量在17KDa和22KDa之间。藻蓝蛋白的纯度越高，售价越高，根据其纯度的不同可分为：食品级＞0.7，药品级＞3.0和试剂级＞4.0。藻蓝蛋白具有抗氧化性、抗癌性、免疫荧光性等功效，被广泛用作天然色素(食品、化妆品、染料等)、医药保健品和分子生物学研究中的荧光试剂。水华蓝藻中藻蓝蛋白的含量达5％以上，从水华蓝藻中提取纯化较高纯度的藻蓝蛋白，即可实现水华蓝藻的无害化，又可实现其资源化。传统的藻蓝蛋白提纯方法包括：透析、双水相萃取、羟基磷灰石等柱分离和多步盐析。透析法周期较长，提纯效果有限；双水相萃取法纯化效果有限，且藻蓝蛋白易与PEG结合；羟基磷灰石等柱分离纯化效果明显，但操作成本高昂，藻蓝蛋白回收率低；多步盐析法应用广泛，纯化效果较好，但操作繁琐，周期较长。针对这一现状，本专利技术吸取盐析法的优点，采用活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白，原理是活性炭的孔隙结构能够吸附色、嗅、味和有机物，可以有效去除藻液中的藻毒素、叶绿素、嗅味物质和有机物，使藻蓝蛋白纯度得到较大的提升，条件温和、易于放大；而盐析法使用中性盐来中和溶液中蛋白质的电性，并与水结合破坏蛋白质表面的水化膜，使蛋白质相互结合形成沉淀析出，应用成熟、材料广泛。相比较传统的提纯方法，采用活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白操作简单、周期短、成本低、制备量较大、蛋白质回收率高。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白的方法，用于解决现有技术中藻蓝蛋白提纯效果低、操作繁琐，周期较长等问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：A.将蓝藻进行破壁以产生藻液；B.将所述藻液进行固液分离，然后将所得液体进行离心，之后取上清液，以获得藻蓝蛋白粗提液；C.向上述藻蓝蛋白粗提液中加入适量活性炭，搅拌并静置后离心，再次获得上清液；D.向步骤C中获得的上清液中加入硫酸铵，搅拌并静置后离心，第三次获得上清液；E.向步骤D中获得的上清液中追加适量硫酸铵，搅拌并静置后离心，获得沉淀，将沉淀用磷酸缓冲液溶解，获得藻蓝蛋白溶液。优选地，所述步骤A是将-10℃条件下冷冻保存的新鲜蓝藻在25～35℃下融化，然后再放入-10℃条件下冷冻，重复此步骤至少2次，可以实现蓝藻细胞的破壁。优选地，所述步骤B是将蓝藻破壁后的溶液用多层纱布粗过滤，去除藻渣。优选地，所述步骤C中所用活性炭为粉末状活性炭；活性炭粉末添加的质量浓度范围为100～200g/L，静置时间为5～20min。优选地，所述活性炭粉末颗粒目数≥200目。优选地，所述活性炭粉末为煤质活性炭粉末。优选地，所述步骤D中硫酸铵添加量为0.8～1.2mol/L。优选地，所述步骤E中追加硫酸铵使其物质的量浓度达到1.8～2.2mol/L优选地，所述步骤E中溶解用的磷酸缓冲液的浓度为0.0025mol/L。优选地，离心温度均为4℃，离心速度均为8000转/分。上述步骤制备的(A620/A280)＞3.0，满足药品级藻蓝蛋白纯度的要求。如上所述，本专利技术的一种活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白的方法，具有以下有益效果：本专利技术提供的藻蓝蛋白制备方法具有操作简单、成本低廉、蛋白质回收率高、适合工业化生产等特点。本方法的藻蓝蛋白回收率≥30％，藻蓝蛋白的纯度(A620/A280)＞3.0。王巍杰在其《盐析法分离藻蓝蛋白的研究》(食品科技2010年第35卷第5期第238-241页)一文中提出，将螺旋藻经过六步盐析操作后，藻蓝蛋白纯度可达3.61，回收率为47.13％。螺旋藻中藻蓝蛋白的含量高达10％～20％，本专利技术以藻蓝蛋白含量5％的蓝藻为原料制备药品级藻蓝蛋白，与传统多步盐析法相比，在达到药品级纯度＞3.0的要求、并兼顾蛋白质回收率的前提下，省去了近三分之一的操作步骤，节省了时间，减少了试剂用量，节约了成本，提高了藻蓝蛋白提纯的效率，并可以放大。因此，本专利技术提供的药品级藻蓝蛋白提取纯化方法为实现水华蓝藻的资源化、推动藻蓝蛋白的广泛应用提供了基础。附图说明图1显示为本专利技术的活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白的流程图。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本专利技术的基本构想，遂图式中仅显示与本专利技术中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。本专利技术提供的活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白，其原理是：活性炭的孔隙结构能够吸附色、嗅、味和有机物，将其加入藻蓝蛋白粗提液中，可以优先吸附分子量500～3000的有机物，如藻毒素、叶绿素、嗅味物质和其他小分子量杂质，使得溶液中杂质的减少量远大于藻蓝蛋白的损失量，从而使藻蓝蛋白的纯度得以较大幅度提升；硫酸铵盐析具有初步纯化和浓缩双重效果，硫酸铵可结合蛋白质溶液中的相反电荷粒子，中和蛋白质的电性，同时硫酸铵还会与水结合，从而导致蛋白质表面水化膜的破坏，使蛋白质相互结合聚集形成沉淀析出，通常用低浓度的硫酸铵去除杂蛋白等杂质，再用高浓度硫酸铵溶液沉淀藻蓝蛋白。请参阅图1，本专利技术提供一种活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白的方法，包括以下步骤：A.取-10℃条件下冷冻保存的新鲜蓝藻1L(含水率96.2％)在25～35℃条件下解冻，然后再放入-10℃条件下冷冻，重复此步骤至少2次，可实现蓝藻细胞的破壁，使藻蓝蛋白从细胞内流出。B.将破壁后的新鲜蓝藻浆液用多层纱布粗过滤，去除藻渣；然后在4℃下进行8000转/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：A.将蓝藻进行破壁以产生藻液；B.将所述藻液进行固液分离，然后将所得液体进行离心，之后取上清液，以获得藻蓝蛋白粗提液；C.向上述藻蓝蛋白粗提液中加入适量活性炭，搅拌并静置后离心，再次获得上清液；D.向步骤C中获得的上清液中加入硫酸铵，搅拌并静置后离心，第三次获得上清液；E.向步骤D中获得的上清液中追加适量硫酸铵，搅拌并静置后离心，获得沉淀，将沉淀用磷酸缓冲液溶解，获得藻蓝蛋白溶液。

【技术特征摘要】
1.一种活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
A.将蓝藻进行破壁以产生藻液；
B.将所述藻液进行固液分离，然后将所得液体进行离心，之后取上清液，以获得藻蓝蛋白
粗提液；
C.向上述藻蓝蛋白粗提液中加入适量活性炭，搅拌并静置后离心，再次获得上清液；
D.向步骤C中获得的上清液中加入硫酸铵，搅拌并静置后离心，第三次获得上清液；
E.向步骤D中获得的上清液中追加适量硫酸铵，搅拌并静置后离心，获得沉淀，将沉淀
用磷酸缓冲液溶解，获得藻蓝蛋白溶液。
2.根据权利要求1所述的活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于：
所述步骤A是将-10℃条件下冷冻保存的新鲜蓝藻在25～35℃下融化，然后再放入-10℃
条件下冷冻，重复此步骤至少2次，可以实现蓝藻细胞的破壁。
3.根据权利要求1所述的活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于：
所述步骤B是将蓝藻破壁后的溶液用多层纱布粗过滤，去除藻渣。
4.根据权利要求1所述的活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于：
所述步骤C...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪家权，盛晶梦，张发宇，袁梦媛，鲁轶男，孙秋阳，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34