本文提供包含以下的表达载体：与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列，所述第一表达调控序列包含启动子；和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列，所述第二表达调控序列包含应答元件，所述应答元件随着一种或多种细胞分化或去分化而被激活或失活。亦提供用于包含表达载体的干细胞成像并监测所述干细胞的方法及试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】领域本专利技术总体上涉及细胞成像，并且更具体地是对用干细胞中的新型表达载体表达的报告核酸序列成像。背景在活体对象中对单个细胞或细胞群无侵袭性和重复性成像，是体内跟踪细胞的关键，尤其是在基于细胞的疗法领域。在很多应用中已使用不同成像模式来了解正常生理和疾病进展，所述应用包括基于细胞的疗法、细胞运输或基因疗法研究。含有报告核酸序列的表达载体在活体对象中对基因表达的无侵袭性定量成像提供可能。为了阐释分子和细胞事件的复杂性和动力学，期需在单个或多个报告基因构建体 的帮助下在单个细胞中对报告基因表达成像。成像的报告基因编码可由各种无侵袭性成像 技术检测的蛋白质。可在活体对象中视报告基因类型而定用以下技术对报告基因表达成像光学成像、正电子发射断层显像(PET)、单光子发射计算机断层成像术(SPECT)或磁共振成像(MRI)。基于干细胞的疗法显示相当大的潜力，尤其是在再生医学领域。基于干细胞的疗法的障碍之一是缺乏有效的监测方法来跟踪采用的干细胞。监测干细胞的分化状态对于确定治疗功效以及可能的有害作用例如植入的干细胞的致瘤性(tumorogenicity)必不可少。可通过用含有内源启动子驱动的报告基因的转基因来评估细胞培养物中或活体对象中的内源基因表达。对植入的干细胞多能性的评估可使得能够预测将来畸胎瘤的形成。与多能性标记相关的启动子驱动的报告基因系统可帮助检测干细胞的分化状态。为了克服每一种模式的缺点，检测多种不同报告基因表达的多模式方法可能是有用的。此外，在活动物中用无侵袭性报告基因成像技术监测干细胞活性的可靠方法是高度期需的目标。简述本专利技术总体上包括包含一个或多个报告序列的表达载体。本专利技术进一步包括用于通过报告核酸表达成像来监测细胞活性的方法和试剂盒。用于监测干细胞的表达载体的实例包含与第一表达调控序列可操作地连接的(operably linked)第一报告核酸序列，和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列。所述第一表达调控序列包含启动子。所述第二表达调控序列包含对细胞分化或去分化的一个或多个阶段应答而激活或失活的应答元件。表达载体的实例包含与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列；和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列。所述第一表达调控序列包含用于一种或多种多能性标记的启动子。所述第二表达调控序列包含对一种或多种应答元件特异性蛋白的结合应答的应答元件。用于监测干细胞的方法实例包括将包含第一报告核酸序列和第二报告核酸序列的第一表达载体递送给所述干细胞；和通过对第一或第二报告核酸序列中至少之一的表达成像来监测干细胞。所述第一报告核酸序列与包含用于一种或多种多能性标记的启动子的第一表达调控序列可操作地连接。所述第二报告核酸序列与第二表达调控序列可操作地连接，所述第二表达调控序列包含应答元件或由一种或多种细胞特异性蛋白调节的细胞特异性启动子，所述应答元件对一种或多种应答元件特异性蛋白的结合应答。用于监测干细胞的试剂盒的实例包含表达载体，其中所述表达载体包含与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列；和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列。所述第一表达调控序列包含0ct4启动子，和所述第二表达调控序列包含对GATA4蛋白的结合应答的应答元件。表达载体的实例包含与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列，所述第一表达调控序列包含用于一种或多种多能性标记的启动子；和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列，所述第二表达调控序列包含受一种或多种细胞特异性蛋白调节的细胞特异性启动子。附图 当参考附图阅读以下详述时将更好地理解本专利技术这些和其它特征、方面和优势，在整个附图中相同的符号代表相同的部分，其中图I为本专利技术具有组成型泛素启动子和细胞特异性0ct4启动子的构建体的实施方案的示意图。图2A-D为显示胚胎干细胞中或分化的成体细胞系中0ct4表达的特异性的图表。图3为在用0ct4-hRLuc瞬时转染的小鼠ES细胞中海肾(renilla)萤光素酶表达的图表。图4A-B为稳定表达0ct4_hRLuc和Ubiq-FLuc-eGFP的小鼠ES细胞的萤光素酶表达的图表。图5为随时间0ct4mRNA水平和P -肌动蛋白mRNA水平的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶相片。图6A是图表，图6B为一系列小鼠的图像，显示活小鼠中包含0ct4_hRLuC表达载体的ES细胞的萤光素酶表达。图6C是图表，图6D为一系列小鼠的图像，显示活小鼠中包含Ubiq-Fluc表达载体的ES细胞的萤光素酶表达。图7为用于通过将应答元件和最小启动子序列插入多克隆位点来制备表达载体的本专利技术方法实例的示意图，所述应答元件对GATA4蛋白的结合应答。图7按出现次序分别公开SEQ ID NO. 5和6。图8为本专利技术表达载体实施方案的示意图，其在pcDNA载体骨架中包含cDNA-编码的GATA4蛋白。图9为编码GATA4蛋白的cDNA序列的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶相片。附图说明图10为与应答元件可操作地连接的报告核酸序列的萤光素酶表达的柱状图，所述应答元件在体外对GATA4蛋白的结合应答。图11为与应答元件可操作地连接的报告核酸序列的萤光素酶表达的柱状图，所述应答元件对ffiK 293细胞中的GATA4结合应答。图12为与应答元件可操作地连接的报告核酸序列的萤光素酶表达的柱状图，所述应答元件对HCT 116结肠癌细胞中的GATA4结合应答。图13为与应答元件可操作地连接的报告核酸序列的萤光素酶表达的柱状图，所述应答元件对用5-氮杂胞苷(5-azacytidine)处理HCTl 16结肠癌细胞后的GATA4结合应答。图14为本专利技术构建体实施方案的示意图，所述构建体包含组成型启动子(泛素)、细胞特异性启动子(0ct4)和应答元件(对GATA4应答)。详述为了更清晰简明地阐述和指出本专利技术要求保护的主题，对在以下说明及所附权利要求书中使用的特定术语提供以下定义。在整个说明书中，应该将特定术语例证理解为非限制性实例。本文所用术语"表达载体"或"表达构建体"，指可用于将特定基因或特定核酸序列或表达序列标签引入靶细胞的质粒。一旦表达载体在细胞内，就可通过细胞转录和翻 译装置来产生由核酸序列编码的蛋白质。表达载体可包含调节核酸序列或表达调控序列、转录起始序列、目的核酸序列(例如报告核酸序列)、转录终止序列或其组合。表达调控序列可包含充当用于有效转录编码目的蛋白的核酸序列或表达序列标签的增强子和/或启动子的序列。本文所用术语"报告核酸序列"或"报告基因"，指编码具有报告活性的蛋白或肽的核酸序列。报告核酸序列可编码可被独立检测的蛋白或肽。常用报告核酸序列编码固有地具有肉眼可识别特性的蛋白或肽(例如荧光蛋白，例如GFP)，或可产生肉眼可识别特性的蛋白或肽(例如生物发光蛋白，例如萤光素酶)。由于将报告核酸序列表达作为标记使用，因此报告核酸序列可用这样的方式来选择，以使得其在研究中的细胞或生物体中非天然表达。报告核酸序列的非限制性实例包括编码绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、萤光素酶、P -内酰胺酶和P -半乳糖苷酶的核酸序列。本文所用术语"可操作地连接的"，意即当两个核酸分子序列彼此连接时，其连接方式为允许两种序列均转录到本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·鲍米克，S·S·贾姆比尔，R·保罗慕鲁甘，S·亚霍比，BC·安，N·帕拉舒拉马，
申请(专利权)人：通用电气公司，
类型：发明
国别省市：
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