用于微流体装置中车载反应剂的脱水储存的组合物及方法制造方法及图纸

描述了用于生产具有分子生物学测试用车载反应剂的独立微流体卡盒装置的制造方法及组合物。敏感性反应剂不经冻干或冷冻以干燥形式进行储存，在使用时以生物学样品或样品稀释剂进行重构。制造方法包括片或卷轴制造过程，其中在凝胶玻璃化前将反应剂印记到位置并密封于单个微流体卡盒中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及具有车载(on-board)脱水反应剂的微流体卡盒(microfluidiccartridge)中的分子诊断性测定法领域，其中反应剂通过不经冻干的脱水得以稳定化，本专利技术还涉及制造具有该车载反应剂的微流体卡盒的方法。相关技术描述 微流体卡盒由于其方便性、非技术人员可操作性以及方便丢弃而非常适用于诊断性分子生物学。每个卡盒包含用于具体测定法的所有反应剂，这样只有样品需要加入。然后简单地将卡盒插入自动化设备便可实施测定法。然而，自从在20世纪90年代早期首次构想以来，开发这些卡盒的道路已经进行了二十年并通过了各种障碍才有商业化的延续。这些卡盒的保质期是尤其值得关注的问题，因为大多数目标用户无法使用冷冻储存设施。尽管“冷冻干燥”已经成功应用于潮湿-敏感性反应剂的室温长期储存，然而微流体卡盒的制造不容易将使用冷冻干燥作为此加工过程的部分。在将反应剂置于部分装配好的装置的孔(well)或通道(channel)内后，需要进行另外的装配。粉末或松散的球(sphere)会移动或不能处于正确的位置，并干扰由片(sheet)或卷轴(roll)形成的卡盒进行高速装配。干燥反应剂也会干扰粘合剂的使用。微流体卡盒的最终装配包含脱掩膜(demasking)、层压(lamination)、粘合(gluing)和/或超声焊接的步骤,这些步骤在商业规模上不易与冷冻干燥技术兼容。而且，微流体卡盒装配中遇到的潮湿或热的环境会使冷冻干燥的反应剂甚至在产品完全装配之前就失活。备选地，已知以玻璃体形式脱水会在冰点(freezing)以上储存过程中保持酶或反应剂的功能，但是此项技术是高度不可预测，并且所述方法和组合物必须针对所研究的每种反应剂而变动——没有具体的成功预期。装配用于分子生物学测定法的独立(self-contained)微流体卡盒中需要的蛋白质反应剂包括=TAQ聚合酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶H、蛋白酶K、免疫球蛋白、突光素酶、焦磷酸酶、发色肽酶(chromopeptidase)、溶菌酶等等。其他可能对光、潮湿或热具有敏感性的反应剂包括核苷酸三磷酸、脱氧核苷酸三磷酸、引物和探针。PCR是分子生物学测定法的庞大家族的基础，并且目前是不可用于微流体卡盒形式的许多分子诊断的金标准。采用PCR用于微流体形式涉及开发用于反应剂的稳定车载储存的方法，所述反应剂包括TAQ聚合酶、逆转录酶、脱氧核苷酸三磷酸、引物和探针。已经证明PCR中所使用的嗜热生物体的DNA聚合酶-由于其首次发现于水生栖热菌(Thermusaquaticus)中而通常称为“TAQ聚合酶”——尤其在室温储存时很难稳定。尽管如此，开发在微流体装置中在室温下具有商业有效保质期的PCR产品依赖于该问题的解决。TAQ具有5’ -3’的聚合酶以及外切核酸酶活性，却没有其他聚合酶的3’ -5’的校对(proofreading)能力。然而，该酶结构是与其他DNA聚合酶共有的，并且包含对生拇指内收(opposable thumb-palm)结构域,其被与DNA模板结合相关的深裂口所分开。与TAQ聚合酶的热稳定性相关的特征包括Arg对Lys、Glu对Asp、Ala对Gly、Thr对Ser的比例升高以及不含半胱氨酸。在升高的温度下的折叠通过疏水作用、氢键、静电及范德华相互作用而建立并维持。酶是复杂折叠的纳米机器，具有与其催化功能及折叠相关的协作运动和灵活性。特定的结构性亚结构域在结构中相对固定，而其他亚结构域更具高流动性和动态性。理想的是，这种天然状态在通过脱水的储存期间得到保持，但是脱水最经常地导致一定水平的折叠去稳定。酶的去折叠会导致变性和活性丧失；脱水(或冷冻)之后产生的结构变化可严重到在再水合之后不会发生重新折叠成为活性“天然状态”形式。已经牢牢确立了水在酶结构中的作用。蛋白质的水合程度可由“Dh”表示，其中Dh^O. 4(g H20/g蛋白质)表示蛋白质周围有完全水合外壳或单层水。水合的中间水平也 是已知的。在Dh 0. 15-0. 2时，水仅仅足以与更高极性和离子化的表面结合，而酶活性丧失。最极端的冻干过程导致Dh ^ 0. 02。在没有水的电介质屏蔽(dielectric shielding)时，静电相互作用可导致变性。水通过水合外壳中氢键连续的断裂和重建(导致疏水和亲水相互作用)，以及通过由肽间和侧链相互作用引导二级和四级结构如a-螺旋和￠-折叠基序而控制了蛋白质结构。作为溶剂，水的液晶态、氢键合能力润滑或“弹性化” 了酶的结构性结构域的运动。无定形固体优选地用于反应剂的“干燥”储存，因为再水合过程比用于相对应晶体状态更迅速。理想的是，蛋白质稳定化于固体的、非吸湿性的玻璃样(glassy)基质中，当以过量的水再水合时，其发生受控的失透作用(devitrification)。此优选状态与通过过冷液体而形成的玻璃样状态有很多共同点。类似地，可在温度Td(动态转化温度(dynamicaltransition temperature))或以下将蛋白质结构域以无定形“玻璃样”或凝胶样状态进行冷冻，此温度类似于形成小分子和聚合物中玻璃样状态的Tg(玻璃转化温度)。在Td以下，蛋白质去折叠受到有效的抑制。类似地，脱水到临界水平可与蛋白质去折叠的抑制相关尽管室温下可用的热能足以使蛋白质变性，但是在Dh < 0. 2时水合外壳碎片化，并且没有足够的水分子以执行与蛋白质结构域的去折叠相关的氢键的重排。尤其感兴趣的是蛋白质在由冻干保护剂(Iyoprotectant)(其为在干燥储存过程中保护蛋白质不发生变性的分子)组成的玻璃体(glass)内的脱水。冻干保护剂的活性最好地可由“水置换模型”解释，其中认为冻干保护剂通过氢键和疏水键与蛋白质直接相互作用，这以某种方式抵消了移除水造成的变性效应。例如，认为甘油在蛋白质水合外壳中置换了水并有效地弹性化了以可再水合形式的脱水蛋白质，尽管其中没有产生水的构象不稳定性。因此，可使用普通的框架来考虑通过用玻璃体形成分子(glass-formingmolecule)冷却紧密混合物中的蛋白质而形成的无定形玻璃样状态以及通过脱水所述混合物而形成的无定形玻璃样状态。在所述两种情况下的固体产物都由具有不同程度的天然状态的蛋白质构象异构体组成，所述蛋白质构象异构体经“溶剂化”并分子上地分散于无定形玻璃体如糖中。例如，已经发现蛋白质和糖混合物在热测量学上具有糖的Tg和蛋白质的Td之间的总Tg中间值，该值与混合物的组成成比例。类似地，蛋白质的Td可通过蛋白质与合适的冻干保护剂的紧密结合而进行调节，尽管机制并未完全理解。因此，人们相信去水的蛋白质的构象会以某种方式缀合于玻璃体的分子结构。通常地，候选的冻干保护剂包括多羟化合物(PHC)，具体而言为多种糖类(包括单糖、双糖、三糖和寡糖)、糖醇，以及多种多羟小分子和聚合物。乳糖醇、甘露醇、麦芽糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、肌醇、苏糖醇、山梨醇(葡糖醇)以及甘油为糖醇的实例。非还原性糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、水苏糖、龙胆三糖、松三糖和蜜三糖。是冻干保护剂的糖衍生物包括甲基葡萄糖苷和2’-脱氧葡萄糖，等等。糖酸包括L-葡糖酸盐及其金属盐。对大多数应用不那么优选的包括还原性糖如果糖、芹菜糖、甘本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·F·拜特瑞尔，D·M·霍克斯特拉，J·哈伯，J·R·维利福德，S·N·盖茨，E·R·莱博尔，I·斯普拉格，
申请(专利权)人：精密公司，
类型：发明
国别省市：