用于调节干细胞的组合物和方法及其应用技术

提供了用于调节干细胞分裂决定、尤其是分裂对称性的组合物和方法。已经证实，wnt7a通过诸如卫星干细胞的成体干细胞的表面上所表达的Frizzled-7受体来激活平面细胞极性(PCP)通路，从而促进干细胞的对称扩增。本发明专利技术的组合物和方法可用于例如在体外和体内调节干细胞的分裂对称性、补充和扩增干细胞库以及促进组织的形成、维持、修复和再生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求于2009年4月27日提交的美国临时专利申请第61/172,832号的权益，通过引用将其全文并入。专利
本专利技术通常涉及用于调节干细胞，特别是干细胞的分裂对称性的组合物和方法及其应用。专利技术背景干细胞是能产生多种特化的细胞类型并最终产生终末分化细胞的未分化的或未成熟的细胞。大多数成体干细胞是谱系限制性的，并且通常根据它们的组织来源命名。与任何其它细胞不同，干细胞能自我更新，以便在生物的生存期中需要时，可以几乎不断地提供成熟细胞类型。由于这种自我更新的能力，干细胞在治疗上可用于组织的形成、再生、修复和维持。为了确保自我更新，干细胞经历两种类型的细胞分裂。对称分裂产生两个相同的子代细胞，两个子代细胞都被赋予干细胞的性质，并且能导致干细胞群体的扩增。另一方面，不对称分裂产生一个干细胞和一个具有有限自我更新潜能的祖细胞。祖细胞是短暂扩增细胞，其能在最终分化成为成熟细胞之前经历几轮细胞分裂，即增殖。在成年生物体中，干细胞和祖细胞作为机体组织的修复系统、补充特化细胞并维持诸如血液、皮肤或肠组织的再生器官的正常更新。最近已经确定，卫星细胞代表了由成熟肌肉组织中所见的干细胞和小单核祖细胞所组成的混合群体(Kuang et al.，2007)。成体骨骼肌中的卫星细胞位于它们的驻留肌纤维肌膜和基膜之间的小凹陷中。卫星细胞参与肌肉的正常生长以及受损或患病组织的再生。在未损伤的肌肉中，大多数卫星细胞是静止的，表示它们既不分化也不发生细胞分裂。卫星细胞表达大量的独特基因标志物，包括配对盒转录因子Pax7，其在卫星细胞的功能和存活中起重要的调节作用(Kuang et al.，2006；Seale et al.，2000)。因此，Pax7可用作卫星细胞的标志物。一旦发生损伤，例如身体外伤或劳损、重复性运动或患病，卫星细胞就会被激活，增殖并产生短期扩增的祖细胞群体，所述祖细胞是表达诸如MyoD和Myf5的肌原性调节因子(MRF)的肌原性祖细胞(成肌细胞)。在再生过程的进程中，成肌细胞先经历多轮分裂，然后进行终末分化、与驻留纤维融合或生成新的肌纤维，以重建受损的组织(Charge and Rudnicki，2004)。在影响肌肉的数种疾病或疾病状态中，观察到肌肉量的减少，其与卫星细胞数量的减少和卫星细胞修复、再生和长成骨骼肌的能力的降低相关。影响肌肉的几种示例性的疾病或疾病状态包括诸如恶病质、肌肉弱化或萎缩(包括少肌症)的消耗性疾病、ICU导致的虚弱、手术导致的虚弱(例如膝关节或髋关节置换术之后)和诸如肌营养不良的肌肉退行性疾病。肌肉再生的过程涉及细胞外基质的大量重塑，并且如果发生广泛的损伤，这种再生是不完全的。肌肉中的成纤维细胞沉积瘢痕组织，所述瘢痕组织能影响肌肉功能并且是肌营养不良的病理学的重要部分。肌营养不良是特征为控制运动的骨骼肌或随意肌的进行性虚弱和退变的遗传疾病。在某些形式的肌营养不良中，心肌和一些其它的随意肌也受到影响。在很多情况下，组织学图片显示出纤维大小、肌细胞坏死和再生以及通常在结缔组织和脂肪组织的增殖上的变化。进行性肌营养不良至少包括杜兴氏肌营养不良(DMD)、贝克肌营养不良(BMD)、埃-德二氏肌营养不良、兰迪二氏肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良(FSH)、肢带型肌营养不良、冯·格雷菲-福克斯(von Graefe-Fuchs)肌营养不良、眼咽型肌营养不良(OPMD)、强直性肌营养不良(斯太纳特病)和先天性肌营养不良。目前，还不能治愈这些疾病，但是某些药物和疗法已被证实是有效的。例如，皮质类固醇已被证实能延缓杜兴氏肌营养不良患者的肌肉破坏。尽管皮质类固醇能有效延缓很多患者的疾病进展，但是由于有害的副作用，长期使用皮质类固醇是不可取的。研究人员还在研究某些肌肉建设医学的潜力。一种该类方法是阻断蛋白肌肉抑制素，肌肉抑制素是一种已知在肌肉的生长和发育中起作用的生长因子。例如，肌肉抑制素的特异性单克隆抗体已被证实能改善患肌营养不良的小鼠的状况，据推测是通过阻断肌肉抑制素的作用。然而，肌肉抑制素阻断方法存在问题。例如，阻断肌肉抑制素会干扰卫星细胞帮助替换受损的或死亡的肌细胞。肌肉抑制素被认为能帮助保持卫星细胞处于静止状态直到需要它们时，并且如果没有肌肉抑制素，卫星细胞将被耗尽。此外，已有人提出，肌肉抑制素阻断剂可能由于靶向性太强而无法促进肌肉生长，因为还存在很多与肌肉抑制素相似的限制肌肉生长的蛋白。PCT申请号WO 2007/059612(Rudnicki et al.)描述了一种新的Pax7+/Myf5-卫星干细胞群体。该小组首次证实，卫星干细胞是含有干细胞(Pax7+/Myf5-)和祖细胞(Pax7+/Myf5+)的异质群体。在本公开之前，不清楚卫星细胞是干细胞、定向的祖细胞还是去分化的成肌细胞，并且不清楚细胞龛(niche)是同质的还是异质的。利用Cre/LoxP谱系追踪，该小组鉴定出卫星细胞的亚群体，这群细胞从不表达Myf5并且作为干细胞贮库(还参见Kuang et al.，2007)。该小组成功地分离出Pax7+/Myf5-卫星干细胞，发现该Pax7+/Myf5-卫星干细胞占成体卫星细胞库的大约10％，并且通过不对称的顶端-基底端细胞分裂而产生子代卫星肌原细胞(Pax7+/Myf5+)。FACS分选的Myf5-和Myf5+卫星细胞的移植表明，卫星干细胞能重新形成成体卫星细胞龛并能自我更新(Kuang et al.，2007)。最近已经证实，在骨骼肌再生的过程中，卫星细胞群体由干细胞亚群维持，因而实现个体存活期间的组织稳态和多轮再生(Kuang et al.，2007)。对调节卫星干细胞命运决定的分子网络的了解仍是不清楚的。PCT申请号WO 2004/113513(Rudnicki et al.)公开了通过调节Wnt蛋白的肌原性决定来调节位于卫星干细胞小室之外的CD45+Scal+干细胞非典型群体的增殖或谱系定向的方法和组合物。Wnt基因家族编码超过20种富含半胱氨酸的分泌型Wnt糖蛋白，这些蛋白通过与靶细胞上的Frizzled(Fzd)受体结合来发挥作用。Frizzled受体属于G蛋白偶联受体蛋白家族。Wnt家族不同成员与Fzd家族某些成员的结合可以通过数种不同通路中的一种起始信号转导。在所谓的经典通路中，信号分子蓬乱蛋白(Disheveled)的激活导致糖原合酶激酶-3(G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.04.27 US 61/172,8321.用于调节干细胞的分裂对称性的组合物，包含作为活性剂的干细
胞平面细胞极性(PCP)信号转导的调节剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述活性剂是能促进干细胞对
称分裂的PCP信号转导的激活剂。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述活性剂包含或衍生自
小分子、多核苷酸、肽、多肽、大分子、抗体或以上的组合。
4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述活性剂包含
以下中的一种或多种：
(a)能结合和/或激活Fzd7的肽或多肽；
(b)编码能结合和/或激活Fzd7的肽或多肽的多核苷酸；
(c)能结合和/或激活Fzd7的小分子；
(d)能上调干细胞上Fzd7的表达的多核苷酸或多肽；或
(e)能诱导或激活PCP通路中的效应分子进而促进对称分裂的
多核苷酸或多肽。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述活性剂包含(a)Wnt7a多肽
或Wnt7a多肽的能结合并激活Fzd7的活性变体、片段、类似物或衍生物，
或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活Fzd7的活性变体、
片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述活性剂包含
Wnt7a多肽。
7.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述活性剂包含
编码Wnt7a多肽的多核苷酸。
8.如权利要求5所述的组合物，其中所述多核苷酸位于表达载体中。
9.如权利要求4所述的组合物，其中所述效应分子是Vangl2、α7-
整联蛋白、Prickle1或Celsr2。
10.如权利要求4所述的组合物，其中所述能调节PCP通路的多核
苷酸或多肽诱导Vangl2在细胞膜中的表达或极化分布。
11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，还包含干细胞或干
细胞群体。
12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，还包含干细胞中经
典Wnt/β-连环蛋白信号转导的抑制剂。
13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，还包含一种或多种
干细胞调节剂。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述调节剂能增加干细胞分
裂的速率。
15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述干细胞是
成体干细胞。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述成体干细胞是卫星干细
胞。
17.权利要求1至16中任一项所述的组合物，其用于促进组织形成、
再生、维持或修复。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述组织是肌肉。
19.如权利要求17所述的组合物，其中所述肌肉是骨骼肌。
20.用于增强哺乳动物中组织形成、再生或修复的组合物，包含作为
活性剂的(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活Fzd7的活性变体、
片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合
并激活Fzd7的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
21.如权利要求1至20中任一项所述的组合物，其与生理学可接受
的载体或稀释剂混合。
22.如权利要求1至21中任一项所述的组合物，其被配制成用于注
射。
23.如权利要求22所述的组合物，其被配制成用于静脉内注射、肌
肉内注射、心内注射、皮下注射或腹膜内注射中的一种或多种。
24.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于促进有需要的人
类个体中骨骼肌的形成、维持、修复或再生。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述个体患有、疑似患有或
有风险患有退行性疾病。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述退行性疾病是肌营养不
良。
27.如权利要求26所述的组合物，其中肌营养不良选自杜兴氏肌营
养不良(DMD)、贝克肌营养不良(BMD)、埃-德二氏肌营养不良、兰迪二
氏肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良(FSH)、肢带型肌营养不良、冯·
格雷菲-福克斯肌营养不良、眼咽型肌营养不良(OPMD)、强直性肌营养
不良(斯太纳特病)和先天性肌营养不良。
28.如权利要求24所述的组合物，其中所述肌营养不良是杜兴氏肌
营养不良(DMD)。
29.如权利要求24所述的组合物，其中所述个体患有、疑似患有或
有风险患有影响肌肉的疾病或疾病状态。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述影响肌肉的疾病或疾病
状态是消耗性疾病(例如恶病质，其可以与诸如癌症或AIDS的疾病相关)、
肌肉弱化或萎缩(例如少肌症，其可以与衰老相关)、ICU导致的虚弱、长
期废用(例如昏迷、损伤、瘫痪)、手术导致的虚弱(例如，膝关节或髋关
节置换术之后)或肌肉退行性疾病(例如肌营养不良)。
31.如权利要求24所述的组合物，其中所述个体患有、疑似患有或
有风险发展出与损伤或疾病相关的肌肉消耗或萎缩。
32.调节干细胞分裂对称性的方法，包括将所述干细胞与组合物接
触，所述组合物包含作为活性剂的干细胞平面细胞极性(PCP)信号转导的
调节剂。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述活性剂是能促进干细胞对
称分裂的PCP信号转导的激活剂。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中所述活性剂包含或衍生自
小分子、多核苷酸、肽、多肽或以上的组合。
35.如权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述活性剂包含
以下中的一种或多种：
(a)能结合和/或激活Fzd7的肽或多肽；
(b)编码能结合和/或激活Fzd7的肽或多肽的多核苷酸；
(c)能结合和/或激活Fzd7的小分子；
(d)能上调干细胞上Fzd7的表达的多核苷酸或多肽；或
(e)能诱导或激活PCP通路中的效应分子进而促进对称分裂的
多核苷酸或多肽。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述活性剂包含(a)Wnt7a多肽
或Wnt7a多肽的能结合并激活Fzd7的活性变体、片段、类似物或衍生物，
或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活Fzd7的活性变体、
片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
37.如权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述活性剂包含
Wnt7a多肽。
38.如权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述活性剂包含
编码Wnt7a多肽的多核苷酸。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述多核苷酸位于表达载体中。
40.如权利要求31所述的方法，其中所述效应分子包含Vangl2、α7-
整联蛋白、Prickle1或Celsr2。
41.如权利要求35所述的方法，其中所述能调节PCP通路的多核苷
酸或多肽诱导Vangl2在细胞膜中的表达或极化分布。
42.如权利要求27至36中任一项所述的方法，还包括将所述干细胞
与干细胞中经典Wnt/β-连环蛋白信号转导的抑制剂接触。
43.如权利要求27至37中任一项所述的方法，还包括将所述干细胞
与一种或多种干细胞调节剂接触。
44.如权利要求38所述的方法，其中所述调节剂能增加干细胞分裂
的速率。
45.如权利要求33至44中任一项所述的方法，其是体内方法，并且
其中将所述组合物给予有需要的个体.
46.如权利要求45所述的方法，还包括将干细胞给予所述个体。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述干细胞与所述组合物同时
给予或相继给予。
48.如权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述组合物包含
干细胞。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述干细胞包含表达载体，所
述表达载体包含编码Fzd7或能促进对称分裂的PCP信号转导的调节剂的
多核苷酸。
50.如权利要求45所述的方法，还...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·A·鲁德尼茨基，法比恩·莱·格朗，
申请(专利权)人：渥太华医院研究所，
类型：发明
国别省市：