本发明专利技术描述了含油酵母解脂耶氏酵母的工程化的菌株，所述菌株能够生产包含按总脂肪酸的重量百分比计的[“％TFA”]高于50重量％的二十碳五烯酸[“EPA”](一种ω-3多不饱和脂肪酸)，并且具有至少3.1的EPA％TFA对亚油酸比值(以％TFA测量)的油。这些菌株除其他异源的Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶、C16/18延伸酶外，还过表达至少一种Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶复合酶，并任选地过表达二酰基甘油胆碱磷酸转移酶、丙二酰-辅酶A合成酶和/或酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶。至少一种过氧化物酶体生物合成因子蛋白的表达被下调。主张了在所述宿主细胞中生产EPA的方法、从所述细胞获得的油、和由此生产的产品。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于生物
更具体地讲，本专利技术涉及工程化的含油酵母解脂耶氏酵母菌株，该菌株能够有效地生产高浓度的二十碳五烯酸一一种《_3多不饱和脂肪酸。
技术介绍
二十碳五烯酸在临床上和制药上的价值是众所周知的(美国专利申请公布2009-0093543-A1)。类似地，相对于从天然的微生物源或通过分离从鱼油和海洋浮游生物生产EPA，利用重组方法在微生物中生产EPA的优点也是被充分认可的。尽管文献报道了负责EPA的生产的《-3/ -6多不饱和脂肪酸生物合成途径的多个部分在其中被引入植物和非含油酵母的许多最近的实例，申请人的受让人的主要努力聚焦在含油酵母解脂耶氏酵母(美国专利7，238，482;美国专利申请公布2006-0115881-A1 ;美国专利申请公布2009-0093543-A1)上。将含油酵母定义为那些天然能够合成并积聚油的酵母，其中积聚的油为细胞干重的至少25 %。更具体地讲，美国专利申请公布2006-0115881-A1展示了通过表达下列基因在重组解脂耶氏酵母菌株中占总脂肪酸9%的EPA的生产而无Y-亚麻酸的共合成A 9延伸酶、A 8去饱和酶、A 5去饱和酶、A 17去饱和酶、A 12去饱和酶和C16/18延伸酶。美国专利申请公布2009-0093543-A1描述了用于生产EPA的优化的重组解脂耶氏酵母菌株，并展示了通过在其天然的过氧化物酶体生物合成因子10蛋白(PEXlO)中包含破坏的宿主细胞中表达下列基因，在重组解脂耶氏酵母菌株中占总脂肪酸55. 6%的EPA的生产△ 9延伸酶、A 8去饱和酶、A 5去饱和酶、A 17去饱和酶、A 12去饱和酶、C16718延伸酶和二酰基甘油胆碱磷酸转移酶。尽管有以上引用的公开，除高的总脂质含量外，还允许占总脂肪酸的高重量％的EPA生产，同时使中间体脂肪酸如亚油酸的生产和最终的油产物中的副产物脂肪酸最小化的EPA商业生产，但是菌株的改善依然是必要的。通过工程化改善的优化的解脂耶氏酵母菌株，申请人已解决了上述问题，其中所述改善允许下列中的至少一种总油级分中61. 8% EPA的生产，按干细胞重量的百分比计39. 6%的总脂肪酸的生产，或具有6. I的EPA对LA比值的脂质的生产。专利技术概沭在第一个实施方案中，本专利技术涉及生产油的重组耶氏酵母属宿主细胞，所述油包含(a)按总脂肪酸的重量百分比计至少50%的二十碳五烯酸；并且(b)所述油按总脂肪酸的重量百分比计的二十碳五烯酸与按总脂肪酸的重量百分比计的亚油酸的比值为至少3. I。在第二个实施方案中，本专利技术涉及权利要求I的重组耶氏酵母属宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(a)至少一种包含多肽的复合酶，所述多肽具有连接到至少一种A8去饱和酶的至少一种A9延伸酶；(b)至少一种其表达被下调的过氧化物酶体生物合成因子蛋白；和(C)至少一种重组构建体，所述构建体包含至少一种编码酶的核苷酸序列，所述酶选自丙二酰-辅酶A合成酶和酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶。优选地，所述丙二酰-辅酶A合成酶基本上由以下序列组成，所述序列选自SEQ IDNO 40 和 SEQ ID NO :42。优选地，所述酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶基本上由以下序列组成，所述序列选自 SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO 31 和 SEQID NO :32。优选地，所述复合酶连接子选自SEQID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :7。优选地，所述复合酶基本上由以下序列组成，所述序列选自SEQ ID NO :9、SEQ IDNO 11 和 SEQ ID NO :13。在第三个实施方案中，本专利技术涉及用于制备包含二十碳五烯酸的微生物油的方法，所述方法包括a)培养任何本专利技术的宿主细胞，其中包含二十碳五烯酸的微生物油被生产；以及，b)任选地回收步骤(a)的微生物油。在第四个实施方案中，本专利技术涉及进一步加工通过本专利技术的方法制备的油。在第五个实施方案中，本专利技术涉及用于生产包含按总脂肪酸的重量百分比计至少50%的二十碳五烯酸的油的重组宿主细胞，所述宿主细胞选自具有ATCC名称ATCCPTA-10025的解脂耶氏酵母Y8406 ;具有ATCC名称ATCC PTA-10026的解脂耶氏酵母Y8412 ；和，具有ATCC名称ATCCPTA-10027的解脂耶氏酵母Y8259。牛物保藏下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection) (ATCC) (10801University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209),并且具有下列名称、保藏号和保藏日期。权利要求1.生产油的重组耶氏酵母属(Yarrowiasp)宿主细胞,所述油包含 (a)按总脂肪酸的重量百分比计至少50%的二十碳五烯酸；并且， (b)所述油按总脂肪酸的重量百分比计的二十碳五烯酸与按总脂肪酸的重量百分比计的亚油酸的比值为至少3. I。2.权利要求I的重组耶氏酵母属宿主细胞，其中所述宿主细胞包含 (a)至少一种包含多肽的复合酶，所述多肽具有连接到至少一种AS去饱和酶的至少一种A9延伸酶； (b)至少一种其表达被下调的过氧化物酶体生物合成因子蛋白；和， (c)至少一种重组构建体，所述构建体包含至少一种编码酶的核苷酸序列，所述酶选自丙二酰-辅酶A合成酶和酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶。3.权利要求2的重组宿主细胞，其中所述丙二酰-辅酶A合成酶基本上由选自SEQIDNO 40和SEQ ID NO 42的序列组成。4.权利要求2的重组宿主细胞，其中所述酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶基本上由以下序列组成，所述序列选自 SEQ ID NO 15,SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO 31 和 SEQ ID NO :32。5.权利要求2的重组宿主细胞，其中所述复合酶连接子选自SEQID NO=USEQ ID NO2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :7。6.权利要求2的重组宿主细胞，其中所述复合酶基本上由以下序列组成，所述序列选自 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 11 和 SEQ ID NO :13。7.用于制备包含二十碳五烯酸的微生物油的方法，所述方法包括 a)培养权利要求1-5中任一项的宿主细胞，其中包含二十碳五烯酸的微生物油被生产；以及， b)任选地回收步骤(a)的微生物油。8.权利要求7的方法，其中步骤(b)的回收的油被进一步加工。9.用于生产油的重组宿主细胞，所述油包含按总脂肪酸的重量百分比计至少50%的二十碳五烯酸，所述宿主细胞选自具有ATCC名称ATCC PTA-10025的解脂耶氏酵母Y8406 ;具有ATCC名称ATCCPTA-10026的解脂耶氏酵母Y8412 ;和，具有ATCC名称ATCCPTA-10本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：SP·洪，P·L·夏普，Z·薛，N·S·亚达夫，Q·朱，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：发明
国别省市：
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