本发明专利技术涉及一种由链孢囊菌C-3560产生的抗肿瘤活性物质，所述抗肿瘤活性蛋白分子量为10.8kDa，其N-末端序列如序列表SEQ?ID?No.1所示；该活性物质生物学实验研究结果证明，其对体外培养的多种肿瘤细胞有明显的抗肿瘤活性，可诱导肿瘤细胞凋亡，并产生细胞周期阻滞；体内动物实验确证，其可明显抑制小鼠H22肝癌的肿瘤生长，有望进一步研发成为临床有效的抗肿瘤药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及ー种由链孢囊菌产生的抗肿瘤活性物质，具体而言，涉及ー种具有抗肿瘤活性的蛋白和N-端序列及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
迄今，已有超过10余种微生物来源的抗肿瘤抗生素作为抗癌药物应用于临床中。它们均来源于微生物发酵的次级代谢产物或经微生物次级代谢产物进行的半合成。由于自然界微生物的来源多样性和次生代谢产物的多样性，已报道的由微生物产生的抗肿瘤活性物质为数众多。然而，临床上使用的许多已知抗肿瘤抗生素的药学特性(如毒性、药效、适应 症和耐药肿瘤细胞株的产生等)还存在诸多不如人意之处。因此，人们不断筛选新的菌株和新的抗生素，以期获得更加高效、低毒、具有良好药学特性的抗肿瘤药物。随着新的抗肿瘤筛选模型和筛选方法的建立，更多的抗肿瘤活性化合物被发现，作为抗肿瘤药物研究的先导化合物，有望进ー步研发成为临床有效的抗肿瘤药物。本研究所在筛选抗肿瘤抗生素的过程中，从我国湖北省武汉市珞珈山土壤样品中分离得到一株链孢囊菌属Streptosporangium C-3560,并于2012年5月3日送交位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号CGMCC No. 6059。经多种抗肿瘤筛选模型检验，发现该菌株的发酵产物具抗菌及抗肿瘤活性。经分离、纯化、理化性质鉴定，该活性物质是ー个分子量为10. SkDa的蛋白，N末端30个氨基酸序列，与NCBI数据库的比对结果显示，其与已知蛋白氨基酸序列最高同源性为59% ;-CA《化学文摘》数据库检索结果，未发现相同序列；抗肿瘤活性研究表明，其具有良好的抗肿瘤活性，定名为加迪霉素(JDM)。本专利技术所提供链孢囊菌StreptosporangiumC-3560产生的抗肿瘤抗生素加迪霉素及其应用，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新的具有抗肿瘤活性的蛋白加迪霉素；本专利技术提供了加迪霉素的制备方法；本专利技术还提供了加迪霉素在制备抗肿瘤药物中的应用。所述抗肿瘤活性蛋白加迪霉素分子量为10. 8kDa，其N末端序列如序列表SEQIDNo. I所示Ala Thr Pro Ser Phe Ser Val Thr Pro Ala Thr Gly Val Ser Asp151015Gly Gly Thr Val Thr Ala Thr He Thr Gly Ala Ala Ala Gly Glu16202530。所述加迪霉素的制备方法主要包括以下步骤I)链孢囊菌C-3560发酵液多级培养制备(斜面菌株培养、种子液制备、发酵液制备与浓缩);2)发酵浓缩液离心取上清液，经阴离子交換柱层析，收集流穿液；3)流穿液经疏水层析，洗脱收集活性组分；4)活性组分经凝胶色谱层析，收集活性部分，冷冻干燥，得到加迪霉素。所述加迪霉素生物学实验研究结果证明，其对体外培养的多种肿瘤细胞有明显的抗肿瘤活性，可诱导肿瘤细胞凋亡，并产生细胞周期阻滞；体内动物实验确证,加迪霉素可明显抑制小鼠H22肝癌的肿瘤生长。 专利技术优点:本专利技术所提供的抗肿瘤抗生素加迪霉素是ー个新的蛋白类的抗生素。目前，临床应用的蛋白类抗肿瘤抗生素较少，JDM增加了抗肿瘤药物的来源，为抗肿瘤药物的开发和应用提供了新的物质基础。附图说明图I葡聚糖Sephadex G50凝胶过滤柱层析洗脱图谱其中X轴-收集组分的编号，顺序为从右至左；Y轴-紫外吸收的强度，单位为mV ；图2加迪霉素的HPLC色谱图，检测波长为280nm ；其中X轴ー时间，単位为min;Y轴ー紫外吸收的强度，单位为mAU ;图3加迪霉素的SDS-PAGE电泳图，其分子量约为IlkDa ；其中a—加迪霉素；b—标准蛋白分子量Marker ；图4加迪霉素的MALDI-T0F质谱图其中X轴ー分子离子峰的m/z值'Y轴ー分子离子峰的信号响应值，单位a. u.；其分子离子峰(m/z)为10807. 9[M+H]+以及5403. 8[M+H]2+，确定加迪霉素的分子量为10. 8kDa ；图5加迪霉素对超螺旋质粒DNA pBR322的切割其中I—超螺旋DNA ;II—切 ロ DNA ;III—线性 DNA ; 15、16、17—S印hadexG50 凝胶层析所收集的编号为15、16、17的活性组分；NC — pBR322质粒对照；图6MTT法检测加迪霉素及丝裂霉素对细胞増殖的抑制作用其中横坐标轴为药物的浓度，单位为ymol/l ;纵坐标轴为细胞存活性率(％);— 不同浓度JDM处理的PG细胞;-B·不同浓度JDM处理的HCTl 16细胞；か不同浓度JDM处理的H印G2细胞； 不同浓度MMC处理的PG细胞;_不同浓度MMC处理的HCT116细胞；漏_金圓_不同浓度MMC处理的H印G2细胞；图7加迪霉素作用48小时细胞周期分布图其中加迪霉素的浓度分别为O. 01、0. 05和1.0ymol/l ；图8加迪霉素作用48小时细胞凋亡图其中:加迪霉素的浓度分别为O. 05、0. 1、0. 5、1.(^Ρ5.0μπιο1/1。具体实施例方式以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好的理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。《实施例I》链孢囊菌C-3560的培养特征形态特征在葡萄糖天门冬素琼脂和燕麦粉琼脂插片培养15天后，C-3560菌株形成圆形、卵圆形或不规则形的孢囊，长度大约为8-12 μ m。孢囊内孢子排列成单圈，椭圆形，无鞭毛，不运动，表面光滑。基内菌丝体无横隔，不断裂。气生菌丝呈乳白至白色，长度中等，有分枝的孢子丝较短，直形，表面光滑。形状特征C_3560菌株在8种培养基上的培养特征如表2所示。表2C-3560菌株的培养特征本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤活性蛋白加迪霉素，系由保藏编号为CGMCC No :6059的链孢囊菌C-3560产生，其特征是，所述活性蛋白的分子量为10. 8kDa，其N-末端序列如序列表SEQ ID Nol所示Ala Thr Pro Ser Phe Ser Val Thr Pro Ala Thr Gly Val Ser Asp151015 Gly Gly Thr Val Thr Ala Thr He Thr Gly Ala Ala Ala Gly Glu16202530o2.制备权利要求I所述活性蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：王莹，甄永苏，胡继兰，李毅，范翠敏，尚柏杨，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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