基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，所述方法包括：利用稻瘟病菌孢子图像检测系统获取孢子悬浮液中的孢子显微图像；然后利用图像光照校正、中值滤波、边缘检测、形态学运算对孢子显微图像进行处理，并结合形状特征参数，提取出只含孢子的显微图像；最后采用改进分水岭算法对粘连孢子进行分离，进而实现显微图像中孢子的检测和数量统计。本发明专利技术的稻瘟病菌孢子检测方法能实现稻瘟病菌孢子数量的快速、准确的自动检测，可为稻瘟病室内抗性鉴定过程提供技术支持，也可为田间自动监测稻瘟病菌提供技术参考。

【技术实现步骤摘要】
基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法
本专利技术涉及一种稻瘟病菌孢子检测方法，尤其是一种基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，属于稻瘟病检测

技术介绍
选育和种植抗性品种是防控稻瘟病的有效措施，在稻瘟病室内抗性鉴定中，病菌悬浮液中孢子的数量是影响抗性鉴定结果的重要因素，当悬浮液中的孢子数量不符合接种要求时，将会错误地评估水稻品种的抗性等级；此外，稻瘟病的发生及病害的严重程度与一定区域内病菌(分生孢子)的数量密切相关。因此，研究快速、准确的稻瘟病菌孢子检测方法无论对稻瘟病的抗性鉴定还是田间病害监测都具有重要意义。病菌的常用检测方法有平板菌落计数法、显微镜下人工计数法、比浊法和流式细胞仪测定法等。平板菌落计数法的成本低，但其劳动强度大、检测耗时长；显微镜下人工计数法适用于体积较大菌体的检测，对于个体较小的菌体操作工作量和误差较大；比浊法成本较高，适用于菌体分散良好且干扰少的细菌；流式细胞仪测定法检测速度快，精度高，但设备仪器昂贵。目前，在植物病菌孢子检测方面，通常是操作人员根据显微镜下病菌孢子的形态特征完成检测和计数，由于显微图像中孢子个体小、数量大、杂质多，利用人工计数方法费时费力，且易造成较大计数误差。因此，为了提高稻瘟病菌孢子检测的准确率和自动化水平，需要研究＝一种简便、准确、高效的孢子检测和计数方法。虽然显微图像处理技术检测稻瘟病菌的研究未见报道，但是已有一些学者利用显微图像技术检测其他植物病原菌的研究：1)Chesmore等(ChesmoreD，BernardT，InmanAJ，etal..ImageanalysisfortheidentificationofthequarantinepestTilletiaindica[J].EPPOBulletin，2003，33(3)：495-499.)利用病害图像研究小麦印度腥黑穗病孢子和黑麦草腥黑穗病菌孢子的分类，该研究从病害图像中自动定位孢子，并提取其周长、表面积、突起数及突起的大小、最大(小)半径和圆形度等相关参数作为分类依据；2)张俊祥等(张俊祥，肖茜，方呈祥，等.噬菌斑电子图像的计算机处理及其自动计数[J].中国病毒学，2003，18(4)：387-390.)将噬菌斑制成电子图像，抽取图像中有代表性的区域，利用分水岭算法对图像进行分割处理，将相连的噬菌斑分割成单独的噬菌斑，然后利用区域生长法进行计数；3)张荣标等(张荣标，黄义振，孙晓军，等.基于图像处理的圆褐固氮菌浓度快速检测方法[J].农业机械学报，2012，43(10)：174-178.)通过对圆褐固氮菌微视图像的采集、预处理、分割和特征提取，运用SVM进行识别、分类和计数，获取圆褐固氮菌的浓度，实现了圆褐固氮菌活性的快速检测；4)邓继忠等(邓继忠，李敏，袁之报，等.基于图像识别的小麦腥黑穗病害特征提取与分类[J].农业工程学报，2012(03)：172-176.)利用小麦腥黑穗病害显微图像，采用图像分析与识别技术进行了小麦的矮腥、印度腥及网腥3类病害的分类识别。通过分析，从病害孢子图像的16个形状和纹理特征中，选择长轴、短轴、等价椭圆短轴、周长、面积和熵6个典型特征用于分类，并基于线性核函数建立支持向量机模型，对这3种小麦腥穗病害进行分类鉴定，总体识别率达到82.9％；5)李小龙等(李小龙，马占鸿，孙振宇，等.基于图像处理的小麦条锈病菌夏孢子模拟捕捉的自动计数[J].农业工程学报，2013(2)：199-206.)利用孢子捕捉器捕捉小麦条锈病菌夏孢子，运用显微镜照相技术获得孢子图像，对图像进行基于最近邻插值法的缩放处理、基于K-means聚类算法的分割处理、形态学操作修饰和分水岭分割等一系列的处理，实现夏孢子的自动计数和标记。通常稻瘟病菌孢子在显微镜下人工计数时，放大倍数为10×10，此时，孢子中间部位透明，只含有边界信息，而有时边界信息并不清晰，给图像处理带来很大困难。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述现有技术的缺陷，提供了一种基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，该方法能实现稻瘟病菌孢子数量的快速、准确的自动检测，可为稻瘟病室内抗性鉴定过程提供技术支持。本专利技术的目的可以通过采取如下技术方案达到：基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，所述方法包括：制备孢子悬浮液；利用稻瘟病菌孢子图像检测系统获取孢子悬浮液中的孢子显微图像；然后利用图像光照校正、中值滤波、边缘检测、形态学运算对孢子显微图像进行处理，并结合形状特征参数，提取出只含孢子的显微图像；最后采用改进分水岭算法对粘连孢子进行分离，进而实现显微图像中孢子的检测和数量统计。作为一种实施方案，所述稻瘟病菌孢子图像检测系统包括显微镜、摄像机和计算机，所述计算机中装有NIS-ElementsBR图像采集软件，所述摄像机与计算机连接；所述利用稻瘟病菌孢子图像检测系统获取孢子悬浮液中的孢子显微图像，具体如下：用无菌的细口滴管将稀释的孢子悬浮液在载玻片中央滴1小滴，盖上清洁干燥的盖玻片，将载玻片放置在显微镜的载物台上，选用放大倍数为10×10下观察，找到目标区域，调节摄像机安装位置，使图像正确显示在计算机的显示器中，选择与显微镜相适应的场景模式以及设置白平衡，通过计算机的图像采集软件采集稻瘟病菌孢子显微图像。作为一种实施方案，所述利用图像光照校正、中值滤波、边缘检测、形态学运算对孢子显微图像进行处理，具体包括以下步骤：1)图像光照校正1.1)图像分块：将图像I(i，j)进行M×N分块，其中M＝N＝4；1.2)估算图像背景的灰度：计算每个图像块的像素灰度均值μ和标准差σ，然后以max(min，μ-3σ)作为该区域的背景灰度；其中min为该区域像素的最小灰度值；1.3)图像光照不均匀校正：从原始图像中减去步骤2)计算出的背景灰度图像，以校正光照不均匀；2)中值滤波采用3×3型滤波模板对光照校正后图像进行中值滤波处理；3)边缘检测采用Canny算子进行图像边缘检测，包括：3.1)用高斯滤波器平滑图像；3.2)利用一阶偏导的有限差分来计算梯度的幅值和方向，得到梯度图像；3.3)对梯度幅值进行非极大值抑制；3.4)用双阈值算法检测并且连接边缘；4)形态学运算根据孢子形态特征，采用8×8的圆盘结构元素对边缘检测后的二值图像进行形态学闭运算，孢子内外环空洞均被填充，形成一个封闭的孢子区域；然后采用8×8的圆盘结构元素进行形态学开运算，去除图像中目标物上比结构元素小的突刺和无用边界，切断细长搭接而起到分离作用。作为一种实施方案，所述梯度图像的阈值通过模糊C均值算法确定，并作为Canny边缘检测的高阈值，包括以下步骤：a、将二维空间的梯度图像矩阵转化为一维空间进行处理，将样本分为两类，即孢子与背景，设定聚类预定数目c＝2；b、将梯度图像的灰度值随机分为两类，计算每类的重心，将这些重心作为每类的初始聚类中心，用伪随机数生成法产生隶属度初始矩阵值，μj(xi)是第i个样本对于第j类的隶属度函数，聚类损失函数定义为：其中，A、B分别为图像的长度和宽度；mj为聚类中心；b是控制聚类结果的模糊程度常数，设定b＝2；在式(2)的等式条件下求式(1)的极小值，令Jf对mj和μj(xi)的偏导数为0，得到：c、用当前的聚类中心根据式(4)计算隶属度函本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，其特征在于所述方法包括：利用稻瘟病菌孢子图像检测系统获取孢子悬浮液中的孢子显微图像；然后利用图像光照校正、中值滤波、边缘检测、形态学运算对孢子显微图像进行处理，并结合形状特征参数，提取出只含孢子的显微图像；最后采用改进分水岭算法对粘连孢子进行分离，进而实现显微图像中孢子的检测和数量统计。

【技术特征摘要】
1.基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，其特征在于所述方法包括：利用稻瘟病菌孢子图像检测系统获取孢子悬浮液中的孢子显微图像；然后利用图像光照校正、中值滤波、边缘检测、形态学运算对孢子显微图像进行处理，并结合形状特征参数，提取出只含孢子的显微图像；最后采用改进分水岭算法对粘连孢子进行分离，进而实现显微图像中孢子的检测和数量统计；所述利用图像光照校正、中值滤波、边缘检测、形态学运算对孢子显微图像进行处理，具体包括以下步骤：1)图像光照校正1.1)图像分块：将图像I(i,j)进行M×N分块，其中M＝N＝4；1.2)估算图像背景的灰度：计算每个图像块的像素灰度均值μ和标准差σ，然后以max(min,μ-3σ)作为该区域的背景灰度；其中min为该区域像素的最小灰度值；1.3)图像光照不均匀校正：从原始图像中减去步骤1.2)计算出的背景灰度图像，以校正光照不均匀；2)中值滤波采用3×3型滤波模板对光照校正后图像进行中值滤波处理；3)边缘检测采用Canny算子进行图像边缘检测，包括：3.1)用高斯滤波器平滑图像；3.2)利用一阶偏导的有限差分来计算梯度的幅值和方向，得到梯度图像；3.3)对梯度幅值进行非极大值抑制；3.4)用双阈值算法检测并且连接边缘；4)形态学运算根据孢子形态特征，采用8×8的圆盘结构元素对边缘检测后的二值图像进行形态学闭运算，孢子内外环空洞均被填充，形成一个封闭的孢子区域；然后采用8×8的圆盘结构元素进行形态学开运算，去除图像中目标物上比结构元素小的突刺和无用边界，切断细长搭接而起到分离作用；采用改进分水岭算法对粘连孢子进行分离，具体如下：首先利用距离变换将只含孢子的二值图像转化为灰度图像，然后通过高斯滤波对孢子图像边缘进行平滑，使得每个孢子内部形成一个局部极小值，最后应用分水岭算法对粘连孢子进行分离。2.根据权利要求1所述的基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，其特征在于：所述稻瘟病菌孢子图像检测系统包括计算机、显微镜和摄像机，所述计算机中装有NIS-ElementsBR图像采集软件，所述摄像机与计算机连接；所述利用稻瘟病菌孢子图像检测系统获取孢子悬浮液中的孢子显微图像，具体如下：用无菌的细口滴管将稀释的孢子悬浮液在载玻片中央滴...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐龙，蒋郁，谭永炘，赵柳霖，芦玉龙，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44