本发明专利技术公开了一种用于荧光显微镜细菌计数的抗褪色剂和检测水体细菌数量的荧光显微计数方法，属于环境微生物学领域。本发明专利技术的抗褪色剂为用对苯二胺、氯化钠、磷酸氢二钠、Tris、甘氨酸、甘油溶于去离子水中，调节pH后得到。检测水体细菌数量的荧光显微计数方法包括以下步骤：往水样中加入荧光染料进行染色，再加入上述抗褪色剂工作液进行抗褪色处理，将抗褪色处理的样品经醋酸纤维滤膜抽滤后在荧光显微镜下观察。本发明专利技术检测水体细菌数量的方法省时省力、成本低廉、抗褪色能力强且没有背景荧光干扰，能快速准确检测出水样中细菌的数量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于环境微生物学领域，具体涉及一种用于荧光显微镜细菌计数的抗褪色剂和检测水体细菌数量的荧光显微计数方法。
技术介绍
水体总菌数是反映湖泊、河流水质状况的指标之一。常用的水体总菌数检测方法为培养法，包括平板法、MPN法等。但并非所有的细菌都能培养，因此，培养法会导致检测结果误差较大。为克服培养法的缺点，各种直接计数方法被广泛应用，其中结果相对可靠、并被大家广泛认可的方法包括荧光显微计数法和流式细胞仪计数法。由于流式细胞仪价格昂贵，使用和维护成本高，在水体总菌数检测上应用并不多见。荧光显微直接计数法是最近30年来发展起来的用于细菌计数的新方法，它具有快速、准确等特点，在水样、土壤及沉积物等环境样品中细菌数量的测定中有着广泛的应用。使用的荧光染料也从AO、DAPI发展到SYBR Green系列荧光染料，同时还包括单染色、双染色等方法的开发。在荧光显微计数中常用的滤膜是氧化铝无机滤膜。这种无机滤膜无需任何前处理，使用方便，没有背景荧光，但缺点是价格较贵，能生产的厂家极少，2009-2012甚至出现了厂家搬迁厂址而导致全球断货的局面。因此，研究者们也尝试使用普通的有机滤膜（如醋酸纤维滤膜）进行荧光显微计数。但目前已报道的有机滤膜使用技术和方法中，有机滤膜都要经过复杂费时的前处理以降低背景荧光信号，不适于快速检测，如公开号为101344476的中国专利“细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与计数方法”中使用的滤膜要经过疏水处理和染色烘干后才能用于荧光显微观察。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在克服现有技术的缺陷，提供一种用于荧光显微镜细菌计数的抗褪色剂和检测水体细菌数量的荧光显微计数方法，该方法省时省力、成本低廉、能快速准确检测水体中的细菌数量。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种用于荧光显微镜细菌计数的抗褪色剂，用对苯二胺、氯化钠、磷酸氢二钠、Tris、甘氨酸、甘油溶于去离子水中，调节pH后得到。优选的，每200mL所述的抗褪色剂的储备液通过包含如下步骤的方法制备得到：将1.5-3g对苯二胺、0.5-1g氯化钠、2.5-3.5g磷酸氢二钠、0.2-0.4g Tris、3-5g甘氨酸溶于60-80mL去离子水中，用盐酸和氢氧化钠调节pH至7-8，加入80-100mL甘油，最后再用去离子水定容至200mL。该储备液避光4℃保存，有效期3个月。更优选的，每200mL所述的抗褪色剂的储备液通过包含如下步骤的方法制备得到：将2g对苯二胺、0.8g氯化钠、3.2g磷酸氢二钠、0.25g Tris、4g甘氨酸溶于80mL去离子水中，用0.1M的盐酸或氢氧化钠调节pH至7.2，加入100mL甘油，最后用去离子水定容至200mL。所述的抗褪色剂的工作液为将储备液用无菌针头滤器过滤除菌再用无菌水稀释后得到，工作液现配现用。优选的，将储备液稀释10倍得到工作液。上述抗褪色剂可用于荧光显微镜细菌计数中，能够降低了背景荧光，获得了良好观察效果。一种检测水体细菌数量的荧光显微计数方法，包括如下步骤：往水样中加入荧光染料进行染色，再加入上述抗褪色剂工作液进行抗褪色处理，将抗褪色处理的样品经醋酸纤维滤膜抽滤后在荧光显微镜下观察。优选的，所述的检测水体细菌数量的荧光显微计数方法，包括如下步骤：（1）样品染色：取1mL水样到5mL的离心管中，加入100μL 用无菌去离子水稀释的SYBR Green I荧光染料，常温避光染色5min。（2）抗褪色处理：向步骤（1）染色好的样品中加入其3倍体积的抗褪色剂工作液，混匀后避光静置5min。（3）荧光显微计数：将步骤（2）经抗褪色处理的样品利用真空抽滤装置进行过滤，所用滤膜为普通醋酸纤维滤膜，孔径0.22μm。过滤完毕后，将滤膜取出放置到洁净的载玻片上，使附有细菌的一面朝上，然后在滤膜上滴加一滴抗褪色剂工作液，覆上盖玻片，置荧光显微镜载物台上，以480nm光波激发，40倍物镜下观察，随机计数10个视野中细菌颗粒的数量，并计算平均数。最后按公式Y=AB/C计算出1mL样品中细菌的数量，其中Y表示1mL样品中细菌的数量，A表示一个视野中细菌的平均数，B表示滤膜截留面积，C表示每个视野的面积。本专利技术的主要优点是：（1）本专利技术改变了抗褪色处理方法，降低了背景荧光，获得了良好观察效果。（2）本专利技术无需繁琐的有机滤膜前处理工作，提高了检测效率。（3）本专利技术在检测过程中无需使用昂贵的无机滤膜，降低了检测成本。附图说明图1是本专利技术方法与氧化铝滤膜法计数大肠杆菌DH5α的比较结果图。图2是染色后的水样通过40倍物镜观察的效果图。图3是本专利技术方法获得的武汉市东湖4个子湖水样细菌总数结果图。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制，在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本专利技术的范围。实施例1 抗褪色剂储备液和抗褪色剂工作液的制备（1）抗褪色剂储备液的制备将2g对苯二胺、0.8g氯化钠、3.2g磷酸氢二钠、0.25g Tris、4g甘氨酸溶于80mL去离子水中，用0.1M的盐酸或氢氧化钠调节pH至7.2，加入100mL甘油，最后用去离子水定容到200mL，制成抗褪色剂储备液。抗褪色剂储备液避光4℃保存，有效期3个月。（2）抗褪色剂工作液的制备取1mL抗褪色剂储备液，无菌针头滤器过滤除菌，再用无菌水稀释至10mL，制成抗褪色剂工作液。抗褪色剂工作液现配现用。实施例2 大肠杆菌培养物计数用牛肉膏-蛋白胨液体培养基培养大肠杆菌DH5α至其600nm处的吸光值为0.2时，取2mL菌液，12000g离心10min，舍弃上清液，沉淀再悬浮于2mL无菌生理盐水中备用。取100μL上述备用菌悬液于5mL的离心管中，添加10μL 10×的SYBR Green I荧光染料，避光染色5分钟后加入890μL无菌生理盐水和3mL抗褪色剂工作液，常温避光静置5分钟，然后经0.22μm孔径的醋酸纤维滤膜抽滤。将滤膜放置到洁净的载玻片上，使附有大肠杆菌的一面朝上，然后在滤膜上滴加一滴抗褪色剂工作液，覆上盖玻片，置荧光显微镜载物台上，以480nm光波激发，40倍物镜下观察，随机计数5-10个视野的细菌颗粒数。每毫升菌液细菌数量按公式Y=10×AB/C计算，其中Y表示1mL样品中细菌的数量，A表示一个视野中细菌的平均数，B表示滤膜截留面积，C表示每个视野的面积。同时，利用0.22μm孔径的氧化铝无机滤膜对同样的样品进行相同计数操作，比较2种滤膜计数结果的差异。利用上述2种不同滤膜对3个DH5α培养物进行了计数，所得结果见图1，结果证实本专利技术与获得广泛认可的氧化铝无机滤膜荧光显微计数方法的结果没有差异。实施例3 武汉东湖水样细菌总数检测2014年10月，用500mL矿泉水瓶分别从武汉东湖4个子湖（郭郑湖、牛巢湖、汤菱湖、官桥湖）采集水样，保温箱冷藏运输回实验室。每份水本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于荧光显微镜细菌计数的抗褪色剂，其特征在于：用对苯二胺、氯化钠、磷酸氢二钠、Tris、甘氨酸、甘油溶于去离子水中，调节pH后得到。
【技术特征摘要】
1.一种用于荧光显微镜细菌计数的抗褪色剂，其特征在于：用对苯二胺、氯化钠、磷酸氢二钠、Tris、甘氨酸、甘油溶于去离子水中，调节pH后得到。
2.根据权利要求1所述的用于荧光显微镜细菌计数的抗褪色剂，其特征在于：每200mL该抗褪色剂的储备液通过包含如下步骤的方法制备得到：将1.5-3g对苯二胺、0.5-1g氯化钠、2.5-3.5g磷酸氢二钠、0.2-0.4g Tris、3-5g甘氨酸溶于60-80mL去离子水中，用盐酸和氢氧化钠调节pH至7-8，加入80-100mL甘油，最后再用去离子水定容至200mL。
3.根据权利要求2所述的用于荧光显微镜细菌计数的抗褪色剂，其特征在于：每200mL该抗褪色剂的储备液通过包含如下步骤的方法制备得到：将2g对苯二胺、0.8g氯化钠、3.2g磷酸氢二钠、0.25g Tris、4g甘氨酸溶于80mL去离子水中，用0.1M的盐酸或氢氧化钠调节pH至7.2，加入100mL甘油，最后用去离子水定容至200mL。
4.根据权利要求2所述的用于荧光显微镜细菌计数的抗褪色剂，其特征在于：该抗褪色剂的工作液为将储备液用无菌针头滤器过滤除菌再用无菌水稀释后得到。
5.根据权利要求4所述的用于荧光显微镜细菌计数的抗褪色剂，其特征在于：将储备液稀释10倍得到工作液。
6.权利要求1-5任一项所述的抗...
【专利技术属性】
技术研发人员：沙茜，朱志超，柯文彪，何君，周帆琦，
申请(专利权)人：武汉市环境保护科学研究院，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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