新的肽基α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂合酶制造技术

本发明专利技术申请涉及能够催化α-羟基甘氨酸转化为α-酰胺的酶以及这样的酶用于产生C端α-酰胺化肽的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有肽基a -羟基甘氨酸a -酰胺化裂合酶活性的分离多肽、用于制 备这样的多肽的方法和这样的多肽在用于产生C端a _酰胺化肽的方法中的用途。
技术介绍
在多细胞生物体中，某些肽(“前体”)，像神经肽，是在一连串切割并进一步修饰肽底 物来产生完整功能的生物反应性肽的酶促步骤中翻译后修饰的。该过程在反式_高尔基体 中开始并作为未成熟的分泌颗粒继续。对于多数这类肽，非常重要的晚期翻译后修饰是羧 基端的a酰胺化。C端残基的a酰胺化对于参与人或动物代谢的数种肽激素的活性是关键的。数种 肽激素现今被用作药物治疗人类(例如用于控制肥胖症和/或糖尿病)或作为潜在药物在 开发中。这种肽激素的一个实例是胰淀粉样肽(例如Symlin ，醋酸普兰林肽，其为人胰淀 粉样肽的类似物)。人胰淀粉样肽是37个氨基酸残基的肽，其可用于治疗或预防肥胖症和 /或糖尿病。因此，为了获得完整生物学活性，胰淀粉样肽的C端需要被酰胺化。同样地肽 YY (PYY)应该被a酰胺化以获得完整生物学活性。大肠杆菌(￡ co7i)和酵母被广泛用于真核生物来源的肽的重组表达。然而，由 于C端a _酰胺基的性质，使用基于大肠杆菌和酵母的现有技术微生物表达系统不能将肽 激素表达为活性形式，因为a酰胺化酶在这些生物体中不能被天然表达。因此，C端a酰 胺必须被引入到重组表达肽中，这使用例如具有a酰胺化酶的离体修饰。在数种真核生物体中发现，凭借双功能肽基a-酰胺化单加氧酶(PAM)将具有C 端Gly的肽前体酶修饰为a-酰胺。关于该酶，已描述了多种编码不同同工型的可变剪接 转录物变体。关于多细胞生物体，已专门描述该酶(Metazoa)。将肽中C端Gly残基转化为 a-酰胺是两步过程，其中PAM的N端结构域(命名为PHM)催化甘氨酸转化为a _羟基甘 氨酸，然后PAM的C端结构域(命名为PAL)催化a -羟基甘氨酸转化为a -酰胺。在真核 生物体中，两个催化结构域顺序工作来催化神经内分泌肽为活性a-酰胺化产物。在来自 真核生物体的PAL结构域中，两条二硫桥是高度保守的。虽然通过化学方法合成包含C末端上酰胺基(a酰胺)的小肽是可能的，但是产 生较大的a-酰胺化肽是困难和昂贵的。因此，a酰胺化酶可用于转化重组前体肽为成熟 肽。US4708934描述从甲状腺髓样癌细胞系和组织样品中提取的肽基-甘氨酸a -酰 胺化单加氧酶。US5789234描述通过重组DNA技术产生a -酰胺化酶。W090/08194涉及一种用于通过使用真核生物C端a酰胺化酶从前体肽产生C端 a酰胺化肽的方法。还描述了一种用于真核表达这些C端a酰胺化酶的方法。W089/02460描述一种牛来源的PAM酶、其克隆、cDNA和通过重组DNA技术的表达。EP0448513描述一种用于重组表达来源于非洲爪蟾Cfeflo/ws Lae vis)的肽基甘 氨酸a-羟化单加氧酶的方法，其包括培养用重组杆状病毒转染的昆虫细胞来产生该酶，其中编码肽基甘氨酸a-羟化单加氧酶的DNA已掺入到重组杆状病毒中。EP0465404描述一种来源于非洲爪蟾的酶(PHL ；PAL)、酶的克隆及其在昆虫细胞 中的重组表达，该酶催化切割在C端a-羟化肽的a-羟基甘氨酸部分中的N-C键。US 20060292672描述一种用于表达PAM或其两个催化结构域的一个的细胞系。EP2172550描述一种重组C端a -酰胺化酶衍生物，其不形成来源于非洲爪蟾的C 端a-酰胺化酶中通常存在的5个二硫键中的至少1个，和描述一种在大肠杆菌中重组产 生所述衍生物的方法，其中获得的包含体是增溶的并经历重折叠步骤。专利技术概述本专利技术涉及新的酶，其能够催化肽中a-羟基甘氨酸转化为a-酰胺(肽基a-羟基 甘氨酸a-酰胺化裂合酶活性)。新的肽来源于原核生物体并具有与对真核生物PAL酶所述的不同的物理化学和 结构特性。因此，本专利技术提供具有肽基- a _羟基甘氨酸a _酰胺化裂合酶活性的酶，其特征 在于它们来源于原核生物体。本专利技术还提供具有肽基-a _羟基甘氨酸a _酰胺化裂合酶活性的酶，其特征在于 它们在大肠杆菌中可被表达为可溶性酶促活性蛋白。本专利技术还提供具有肽基-a _羟基甘氨酸a _酰胺化裂合酶活性的酶，其特征在于 它们具有不包含半胱氨酸残基或者包含至多1或至多2个半胱氨酸残基的氨基酸序列。本专利技术还提供一种具有肽基-a _羟基甘氨酸a -酰胺化裂合酶活性的酶，其特征 在于其可通过包括以下步骤的方法产生a)在适合于酶表达的条件下培养重组大肠杆菌 菌株宿主细胞，该细胞包含含有编码酶的核苷酸序列的核酸构建体；和(ii)在宿主细胞破 碎和离心后从上清液中回收酶。本专利技术还提供能够催化肽中a-羟基甘氨酸转化为a-酰胺的酶，其中所述酶具 有包含下述基序(命名为基序1)的氨基酸序列Xaax Val Xaa2 Asp Arg Xaa3 Xaa4 Xaa5 Arg Xaa6 Gin Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaan Gly Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Trp ;其中XaafXaa^独立选自天然存在氨基酸,条件是Xaa: 和Xaa7不是Cys。本专利技术还提供能够催化肽中a-羟基甘氨酸转化为a-酰胺的酶，其中所述酶具 有包含下述基序(命名为基序2)的氨基酸序列Asp Gly Tyr Xaa17 Asn Xaa18 Arg Xaa19 Xaa20 Xaa21 Phe Xaa22 Xaa23 Xaa24 Gly Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Xaa32 Xaa33 Gly Xaa34 Xaa35 Xaa36 Gly Xaa37 Phe ;其中 Xaa17-Xaa37独立选自天然存在氨基酸,条件是Xaa17不是Cys。本专利技术还提供具有肽基_ a -羟基甘氨酸a _酰胺化裂合酶活性的酶，其包含与 选自以下序列的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列(a) SEQ ID NO: 1的氨基酸 2-306 ； (b) SEQ ID NO: 2 的氨基酸3-336 ; (c) SEQ ID NO: 3 的氨基酸3-305 ; (d) SEQ ID NO: 4 的氨基酸3-279 ; (e) SEQ ID NO: 19 ； (f) SEQ ID NO: 20 ； (g) SEQ ID NO: 21 ； (h) SEQ ID NO: 22 和(i) SEQ ID NO: 23。本专利技术另外提供本专利技术的酶在用于通过催化肽中C端a-羟基甘氨酸残基转化 为a-酰胺残基来制备a-酰胺化肽的方法中的用途。本专利技术还提供使用本专利技术的酶产生α-酰胺化肽的方法。此外，本专利技术涉及一种用于通过提供编码本专利技术酶的分离核酸、包含 核酸的载体和宿主细胞由重组技术产生本专利技术酶的方法。附图说明图I :质粒C的典型pETlla载体图谱,其编码来自赤细菌属(Erythrobacter)的 细菌PAL样结构域(SEQ ID NO: I)(不具有预测的信号肽)和N端融合伴侣(SEQ ID NO: 7)以及介于中间的接头区(SEQ ID NO: 8)中的HRV14 3C蛋白酶切割位点(用特征蛋白3 标记整个融合蛋白)。描绘了 Ndel、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：AC肖，
申请(专利权)人：诺沃—诺迪斯克有限公司，
类型：发明
国别省市：