碱性红G检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种碱性红G检测试剂盒，属于添加剂检测技术领域。该试剂盒包括每个微孔内包被浓度为1-3μg/mL碱性红G特异性抗原的酶标板，浓度为1-3μg/mL的碱性红G特异性抗体，且所述碱性红G特异性抗原与碱性红G特异性抗体溶液的用量比为1：1。本发明专利技术还公开了一种碱性红G检测试剂盒制备方法。本发明专利技术的试剂盒在检测碱性红G时可一次连续检测多个样品，具有便捷，快速，灵敏、成本低的特点。适合用于快速而准确得检测大批量样品中的碱性红G。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种添加剂检测技术，具体来说，特别是涉及一种用于碱性红G含量的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
碱性红G，又名罗丹明6G或玫瑰红6G，属酞菁类着色剂，易溶于水和醇，色彩鲜艳，具有优良的匀染性和渗染性，用作工业染色剂。碱性红G为高毒类化学物质，我国、美国、力口拿大、日本、澳大利亚等多国都明确禁止食品和化妆品中使用碱性红G。因此，快速检测碱性红G在食品和化妆品中的含量是非常必要的
技术实现思路
··基于此，本专利技术提供一种碱性红G检测试剂盒和一种碱性红G试剂盒制备方法，该试剂盒在检测碱性红G时可一次连续检测多个样品，具有便捷，快速，灵敏、成本低的特点。本专利技术的第一个目的在于提供一种碱性红G检测试剂盒,其技术方案如下一种碱性红G检测试剂盒，主要包括I)包被碱性红G特异性抗原的酶标板所述酶标板的每个微孔内碱性红G特异性抗原的浓度为1-3 V- g/mL ；2)碱性红G特异性抗体溶液该碱性红G特异性抗体的浓度为1-3 u g/mL ；所述碱性红G特异性抗原与碱性红G特异性抗体溶液的用量比为1:1。在其中一个实施例中，所述碱性红G检测试剂盒还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。在其中一个实施例中，所述碱性红G特异性抗原的浓度为2 u g/mL ;所述碱性红G特异性抗体的浓度为2 u g/mL。在其中一个实施例中，所述碱性红G检测试剂盒还包括碱性红G标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。在其中一个实施例中，所述特异性碱性红G特异性抗体是鼠源单克隆抗体；所述碱性红G特异性抗原为碱性红G与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲状腺球蛋白中的一种；所述碱性红G标准品溶液浓度分别为IXlO5U g/L、IXlO4U g/L、IXlO3U g/L、IXlO2U g/L、IXlO1U g/L、0. 5 u g/L ;所述显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为l-2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有0. 05%-0. 5%吐温-20的0. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5%脱脂奶粉的0. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为0. 01M, pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述酶标板的材料为聚本乙纟布、聚乙纟布、聚丙纟布中的一种。本专利技术的第二个目的在于提供一种碱性红G检测试剂盒制备方法，主要包括以下步骤I)制备包被碱性红G特异性抗原的酶标板将碱性红G分散于0. 01mol/L盐酸中，搅拌，碱性红G的酯基被水解形成羧基；将上述碱性红G羧酸衍生物、N-(3-胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和六氟磷酸苯并三唑-I-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥DMF中，搅拌，反应产物进行柱层析纯化得到中间产物；随后将中间产物加入三氟乙酸中，回流搅拌，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的碱性红G的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌，偶联制备得到碱性红G特异性抗原；将碱性红G特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内碱性红G特异性抗原的浓度为1-3 V- g/mL ；2)制备碱性红G特异性抗体以步骤I)中合成的碱性红G特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫；免疫后，取血清效价高的小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的碱性红G单克隆抗体；所述碱性红G特异性抗体的浓度为1-3 u g/mL。 在其中一个实施例中，上述步骤I)中，制备碱性红G特异性抗原的方法优选为将0. 88g碱性红G分散于50mL的0. 01mol/L盐酸中，55°C搅拌2h，碱性红G的酯基被水解形成羧基；将0.82g的上述碱性红G羧酸衍生物、1.2g N-(3-胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和2. Ig六氟磷酸苯并三唑-I-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥30mL DMF中，65°C搅拌lh，反应产物进行柱层析纯化得到中间产物；随后将中间产物加入30倍的三氟乙酸中，回流搅拌lh，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的碱性红G的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌lh，偶联制备得到碱性红G特异性抗原。在其中一个实施例中，上述步骤2)为以步骤I)中合成的碱性红G特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐剂与碱性红G特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为0. 35mg/mL，剂量为IlOy g/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与碱性红G特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫。初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次,共免疫5-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用碱性红G特异性抗原水溶液腹腔注射，剂量同初次免疫。尾部取血检测血清效价。取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0. 5mL/只；将细胞浓度为I. 4万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0. 5mL/只；接种杂交瘤细胞7 10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4°C冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的碱性红G单克隆抗体。本专利技术的碱性红G检测原理为将碱性红G特异性抗原吸附于固相载体上，加入样品或碱性红G的标准溶液及碱性红G特异性抗体工作液，待测样品中碱性红G和固相载体上包被的碱性红G特异性抗原竞争结合碱性红G特异性抗体，孵育后，加入酶标二抗进行酶活性的放大作用，孵育，显色后终止，测定样品的吸光度，该值与样品中碱性红G的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出碱性红G浓度范围。下面对前述技术方案的优点进行说明本专利技术的碱性红G检测试剂盒，利用竞争酶联免疫测定法检测碱性红G，具有特异性高，结果准确且前处理简单，对仪器设备要求低、检测成本低的特点。同时，本试剂盒中的试剂以工作液形式提供，操作简单、快捷，为使用者节省了时间并减少因步骤复杂造成的误差。适合用于快速而准确得检测大批量样品中的碱性红G。具体实施例方式下面对本专利技术的实施例进行详细说明，但不对本专利技术的内容造成任何限制。实施例I本实施例所述的碱性红G检测试剂盒的主要组成成份如下 I)碱性红G特异性抗原工作液；通过以下方法制得将0. 88g,即2. Ommol碱性红G分散于50mL的0. 01mol/L盐酸中，55°C搅拌2h，碱性红G的酯基被水解形成羧基；将0. 82g，即2. Ommol的上述碱性红G羧酸衍生物、I. 2g,即5mmol N_(3_胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和2. Ig,即4mmol六氟磷酸苯并三唑-I-基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种碱性红G检测试剂盒，其特征在于，主要包括：1）包被碱性红G特异性抗原的酶标板：所述酶标板的每个微孔内碱性红G特异性抗原的浓度为1？3μg/mL；2）碱性红G特异性抗体溶液：该碱性红G特异性抗体的浓度为1？3μg/mL；所述碱性红G特异性抗原与碱性红G特异性抗体溶液的用量比为1：1。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗海英，郭新东，黄金凤，冼燕萍，侯向昶，吴玉銮，吴文海，王斌，
申请(专利权)人：广州市质量监督检测研究院，
类型：发明
国别省市：