本发明专利技术涉及一种拟南芥转录因子在培育抗旱耐盐性水稻中的用途。拟南芥转录因子MYB44的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示；其编码的蛋白序列为SEQIDNo.2所示；符合下列条件之一：1)序列表SEQIDNO.1中第88-1005位所示DNA序列，或与SEQIDNO.1中第88-1005位所示的高度同源DNA序列；2)其它能编码与序列表SEQIDNO.2中的蛋白质相同的DNA序列；3)其功能相当于SEQIDNO.1中第88-1005位所示DNA序列或与SEQIDNO.1中第88-1005位所示的高度同源DNA序列所包含的亚片段，在培育抗旱耐盐性水稻中的应用。本发明专利技术的MYB44基因的表达载体可以生物技术方法导入植物细胞，可以使用包含本发明专利技术的MYB44基因的表达载体转化宿主可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也适用于烟草、大豆等双子叶植物，培育抗旱、耐盐的植物品种。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物生物
，具体涉及一种拟南芥转录因子DNA片段(基因)的分离克隆、转化、功能验证及在水稻中的应用。特别涉及利用该基因增强水稻抗旱耐盐等抗逆性的应用及方法。
技术介绍
干旱和盐溃问题是影响当今世界农业生产与生态环境的两个重要的逆境因子，对世界粮食生产造成巨大的损失。在人口不断增加、耕地面积日趋减少和淡水资源不足的严重压力下，如何高效地利用有限的淡水资源进行最大限度的农业生产，这是国际和国内生物科学技术迫切需要解决的重大课题之一。水稻是世界农业生产中用水最多的作物，其节水抗旱性对我国乃至世界的粮食、水、以及生态安全具有重要的意义。培育抗旱与耐盐作 物品种是更好的发展农作物的经济而有效的方法。传统的方法培育抗旱耐盐品种受到育种时间和优良性状选择的限制，利用转基因技术提高作物的抗旱及耐盐能力具有重要的理论与经济意义，转基因技术为培育高效抗旱耐盐作物新品种开辟了一条崭新的途径。转基因技术是指将外源基因通过生物、物理或化学手段导入其它生物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的遗传改良体。基因转化的方法可分为两类一是由载体介导的转化，主要的方法为农杆菌介导法；另一类是直接的基因转化，包括基因枪法、电击法、PEG法、脂质体转化法和花粉管通道法等。近年来，应用较多的为农杆菌介导法和基因枪法。但是，基因枪法具有价格昂贵、转化效率偏低、导入的外源基因拷贝数高、在后代中容易丢失甚至基因沉默、对片段大的基因难以导入且嵌合体不易排除等缺点，需要进一步改进；农杆菌介导法在水稻转基因种基因型依赖性小，可以很大程度上减少上述不足。抗旱耐盐分子育种的基础就是发掘新的抗旱耐盐基因，已发表的抗旱耐盐相关的基因及其蛋白越来越多。反式转录调节因子包括所有的具有调节基因转录功能的蛋白分子，它们在植物生长发育和抗逆性方面发挥着巨大的作用。利用拟南芥抗旱耐盐相关转录因子及转基因技术可以高效的培育出抗旱的高品质水稻等农作物。
技术实现思路
为了解决培育耐旱水稻品种受到育种时间和优良性状选育的限制问题，本专利技术提供一种拟南芥转录因子在培育抗旱耐盐性水稻中的用途。本专利技术的目的是针对高效培育抗旱耐盐水稻品种的不足，利用农杆菌介导法转基因技术，以水稻为宿主，提供了分离克隆一个包含有抗逆转录因子MYB44的完整编码区段的DNA片段、编码蛋白、以水稻Actinl为启动子构建的MYB44表达载体。本专利技术所设计的序列来源于 NCBI (http://www. ncbi. nih. gov/),在 NCBI 中 Gene ID 为 836865,在拟南芥资源中心，其位点是AT5G67300以及序列信息以以下网站为准(http://www. arabidopsis.org/servlets/Tair0bject id=132479&type=locus),所用的模板是拟南芥的幼苗和根的cDNA，按照其位点信息AT5G67300，我们将其简写为A300。本专利技术从拟南芥的幼苗及根中分离得到一种包含MYB44的DNA片段，通过转化该片段赋予植物干旱耐盐等逆境条件下，增强耐受能力。其中，所述MYB44基因是下列核苷酸序列之一 1)序列表SEQID NO. I中第88-1005位所示DNA序列，或与SEQ ID NO. I中第88-1005位所示的高度同源DNA序列； 2)其它能编码与序列表SEQID NO. 2中的蛋白质相同的DNA序列； 3)其功能相当于SEQID NO. I中第88-1005位所示DNA序列或与SEQ ID NO. I中第88-1005位所示的高度同源DNA序列所包含的亚片段。可以采用已经克隆的MYB44基因作为探针，从cDNA或基因组文库中筛选得到本专利技术的基因或同源基因，也可以采用PCR(Ploymerase Chain Reaction)技术，从基因组DNA、mRNA和cDNA中扩增得到本专利技术的MYB44基因以及任何感兴趣的一段DNA或其同源的一段 DNA。采用上述技术，可以分离得到包含MYB44基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体植株，可获得抗旱及耐高盐胁迫的耐受性增强的转基因植株，本专利技术的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子，也可以使用增强子区域是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等的增强子，且与编码序列阅读框相同，以确保整个序列的翻译。本专利技术基因是受逆境诱导表达的，因此可将本专利技术的基因与任何感兴趣的逆境诱导启动子结合后连入合适的表达载体，转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提高植物在逆境条件下(干旱、高盐及冷胁迫)的存活率和生长速度。携带有本专利技术的MYB44基因的表达载体可以通过Ti质粒、植物病毒载体、农杆菌转化、基因枪等生物技术方法导入植物细胞。可以使用包含本专利技术的MYB44基因的表达载体转化宿主可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也适用于烟草、大豆等双子叶植物，培育抗旱、耐盐的植物品种。下面结合附图及具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。附图说明序列表SEQ ID NO. I显示的是本专利技术分离克隆的包含有MYB44基因编码区和启动子区得DNA片段序列。序列表SEQ ID NO. 2显示的是本专利技术MYB44基因编码的蛋白质序列。图I为MYB44基因的PCR扩增与克隆 提取拟南芥种荚、幼苗和根的RNA，经反转录后获得cDNA，再用Pfu高保真Taq酶以这些cDNA为模板进行PCR扩增；图中M代表Marker，2、3为2个扩增出来的阳性克隆，I为阴性克隆。图2为阳性克隆的筛选 将扩增出的目的片段用低熔点胶回收后，用平端连接的方法连到中间载体中。该载体中有一个Sma I酶切位点，两端分别是AttLl和AttL2，用于重组克隆用的序列。先将载体用Sma I酶切开，形成平端，然后用碱性磷酸酶CIP进行去磷酸化处理防止自连接产生阴性克隆。由于高保真酶不能产生带有磷酸的末端，我们用T4 Polynucleotide Kinase在PCR产物末端加磷酸。将该片段纯化后，放到一起用T4连接酶连接，转入大肠杆菌，筛选阳性克隆。下图是AT5G67300的PCR扩增的筛选图，如图2所示1、2、3、4、5、6、7均为阳性克隆，所用引物为A300FP和A300RP。图3为转基因所用的pCAB水稻表达载体图。图4、图5为转基因水稻M YB44基因逆境胁迫诱导的荧光定量表达 转基因水稻株系分别在干旱(失水)、冷胁迫(2°C)、200mM NaCl及100剛脱落酸(ABA)中胁迫诱导后提取叶(图4)和根(图5)中RNA并反转录后，采用SYBR Green I染料进行荧光定量PCR分析目的基因表达情况。图6为转基因水稻过量表达图；且11、12、13、14、16、23号为过量表达植株。图7为T2代转基因株系的干旱胁迫下的表型图。图8为T2代转基因株系的干旱胁迫下的存活率 干旱胁迫下，T2代过表达转基因株系存活率比WT植株高约48% (WT，12. 9% ;0EX_11，46. 2% ；0EX-12,63. 3% ；0EX-13,46. 9%)。图9为T1代转基因株系的干旱胁迫下的表型图。图10为T1代转基因株系的干旱胁迫下的表型失水率 干旱胁迫本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种拟南芥转录因子在培育抗旱耐盐性水稻中的用途，该拟南芥转录因子的核苷酸序列为SEQ？ID？NO.1所示；其编码的蛋白序列为SEQ？ID？No.2所示，其特征在于：符合下列条件之一：1)序列表SEQ？ID？NO.1？中第88？1005位所示DNA序列，或与SEQ？ID？NO.1中第88？1005位所示的高度同源DNA序列；2)其它能编码与序列表SEQ？ID？NO.2中的蛋白质相同的DNA序列；3)其功能相当于SEQ？ID？NO.1？中第88？1005位所示DNA序列或与SEQ？ID？NO.1中第88？1005位所示的高度同源DNA？序列所包含的亚片段，在培育抗旱耐盐性水稻中的应用。
【技术特征摘要】
2011.07.27 CN 201110211432.31.一种拟南芥转录因子在培育抗旱耐盐性水稻中的用途，该拟南芥转录因子的核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示；其编码的蛋白序列为SEQ ID No. 2所示，其特征在于符合下列条件之一 1)序列表SEQ ID NO. I中第88-1005位所示DNA序列，或与SEQ ID NO. I中第88-1005位所示的高度同源DNA序列；2)其它能编码与序列表SEQ ID NO. 2中的蛋白质相同的DNA序列；3...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈学平，汪洋，曹树青，郭家明，李敏，张银萍，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：
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