植物双向启动子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种植物启动子BIGDB4及其应用。该启动子的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。实验证明，将本发明专利技术的BIGDB4插入载体pMOA34-G/L中的GUS和LUC之间后转化拟南芥和水稻，获得的转基因植株中均能检测到GUS和LUC的表达，说明启动子BIGDB4具有双向驱动目的基因转录的功能。利用本发明专利技术所提供的启动子BIGDB4能够保证多基因在表达量、表达时间和位置同一性的同时，避免多基因插入所引起的基因沉默的现象。

Bidirectional promoter of plants and uses thereof

The present invention relates to a plant promoter BIGDB4 and uses thereof. Nucleotide sequences of the promoter sequence is shown in table SEQ ID No.1. Experiments show that the insertion of BIGDB4 into Arabidopsis and rice between vector pMOA34-G/L GUS and LUC, transgenic plants were detected in the expression of GUS and LUC, that BIGDB4 promoter has bidirectional drive transcription of target gene function. By using the promoter BIGDB4 provided by the invention, the expression, expression time and position identity of the multiple genes can be ensured, and the phenomenon of gene silence caused by multiple gene insertion can be avoided.

【技术实现步骤摘要】
植物双向启动子及其应用
本专利技术涉及植物分子生物学领域中的一种植物双向启动子及其应用。
技术介绍
通过导入外源基因使植物获得新的性状并能稳定遗传是植物基因工程的最终目的。花椰菜病毒CaMV35S启动子作为稳定、高效的外源启动子，一直被人们广泛的使用。然而在转基因过程中由于重复序列的出现会引起基因沉默现象，尤其是进行多个基因导入时，这种现象会更严重，从而严重影响了转基因植株的获得和后代的稳定性。而在进行两个或两个以上基因导入时，通常需要这些基因在表达量、表达时间和位置方面的同一性，进而确保转入基因行使正常的功能，使用35S启动子很难达到这样的要求。这些都是植物基因工程中亟待解决的问题。对于转基因引起的基因沉默现象人们已经有了比较深入的认识，引起转基因沉默有多种因素，其中最主要的就是重复序列的产生，尤其是多个基因导入时，更人为的造成了多个35S启动子插入的情况，对此至今尚无有效的解决方法。随着基因组学的发展，多种生物基因组测序已完成，经过生物信息学分析人们发现了双向启动子的存在，这为我们利用植物自身的双向启动子进行转基因操作，从而避免多基因插入引起的基因沉默现象提供了可能。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种植物双向启动子。为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种DNA分子。上述DNA分子为植物启动子BIGDB4，来源于拟南芥(Arabidopsisthaliana)，其核苷酸序列如下1)或2)或3)所示：1)序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)或2)的核苷酸序列具有65％以上的同一性，且具有启动子活性的核苷酸序列；具体的，所述同一性为90％以上；再具体的为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。其中，序列表中的SEQIDNo.1所示的核苷酸序列由546个脱氧核糖核苷酸组成。上述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12h；弃杂交液，加入洗膜液Ⅰ(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液Ⅱ(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。本专利技术的DNA分子(启动子活性片段)还包括与序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列互补的核苷酸序列。这里使用的术语“互补的”系指遵循碱基配对原则产生的之意。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的调控片段的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的调控片段的核苷酸序列65％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的DNA分子的核苷酸序列具有65％或更高，优选地75％或更高，更优选地85％或更高，甚至更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。为了解决上述问题，本专利技术还提供了含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组微生物。上述表达盒中含有两个目的基因；上述DNA分子位于上述两个目的基因之间；上述DNA分子启动上述两个目的基因转录。上述两个目的基因可为相同或不同基因。上述目的基因可为报告基因如GUS基因、GFP基因或LUC基因。上述重组载体可为重组克隆载体或重组表达载体。上述重组表达载体可为将上述DNA分子或表达盒构建到现有植物表达载体上得到。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述重组载体具体可为pMOA34-G/L-BIGDB4或pMOA34-G/L-BIGDB4(REV)，是将SEQIDNo.1所示的核苷酸序列插入到中间载体pMOA34-G/L的多克隆位点间得到的；所述中间载体pMOA34-G/L是将GUS基因和LUC基因分别插入pMOA34载体的多克隆位点得到的。上述转基因细胞系不包括繁殖材料。上述重组微生物可为重组菌或重组病毒。本专利技术还提供了上述DNA分子在作为启动子中的应用。上述应用中，所述启动子为双向启动子。本专利技术还提供了上述DNA分子和含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在驱动目的基因在植物体内转录中的应用。上述应用中，所述驱动目的基因在植物体内转录为双向驱动两个目的基因在植物体内转录。本专利技术还提供了上述DNA分子和含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在培育转基因植物中的应用。上述应用可通过重组载体pMOA34-G/L-BIGDB4或pMOA34-G/L-BIGDB4(REV)导入植物中实现。上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥；所述单子叶植物具体为水稻。本专利技术通过实验证明，启动子BIGDB4可同时启动两个基因的高效转录，具有双向驱动目的基因转录的功能。利用本专利技术所提供的启动子能够保证多基因在表达量、表达时间和位置等方面同一性的同时，避免多基因插入所引起的基因沉默的现象。为植物的遗传改造提供了一条经济、快速、有效的途径。本专利技术在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。附图说明图1为pMOA34-G/L-BIGDB4植物双元载体图谱。图2为转基因拟南芥GUS染色结果。A为四叶真叶期幼苗；B为花序；C为子叶期幼苗；D为两片真叶期幼苗。图3为转基因拟南芥LUC分析结果。图4为转基因水稻GUS染色结果。A为转BIGDB4水稻植株；B为转BIGDB4(REV)水稻植株。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。拟南芥(Arabidopsisthaliana)为Columbia-0生态型：ArabidopsisBiologicalResourceCenter(ABRC)，种子号：CS28166。载体pMOA34(Barrell,P.J.andConner,A.J.(2006)MinimalT-DNAvectorssuitableforagriculturaldeploymentoftransgenicplan本文档来自技高网...

【技术保护点】
DNA分子，其核苷酸序列如下1)或2)或3)所示：1)序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)或2)的核苷酸序列具有65％以上的同一性，且具有启动子活性的核苷酸序列；具体的，所述同一性为90％以上；再具体的为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。

【技术特征摘要】
1.DNA分子，其核苷酸序列如下1)或2)或3)所示：1)序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)或2)的核苷酸序列具有65％以上的同一性，且具有启动子活性的核苷酸序列；具体的，所述同一性为90％以上；再具体的为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。2.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒中含有两个目的基因；所述DNA分子位于所述两个目的基因之间；所述DNA分子启动所述两个目...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢旗，夏然，邵琳，魏绍巍，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11