湖北海棠MhSGT1b基因的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，公开了湖北海棠MhSGT1b基因的应用。受低温胁迫的诱导，MhSGT1b在植物中过量表达；在植物受到低温胁迫时，过量表达的MhSGT1b可诱导NtRbohD基因在植株中高水平表达、增强NtPIN1基因和NtSOD基因表达、短暂增强NtSPS的表达水平，从而共同抵御胁迫。MhSGT1b转基因烟草具有较强的抵御低温胁迫的能力，植株可在4℃低温条件下正常生长长达24h，同时也证明了MhSGT1b基因具有提高植物抗寒能力的功能。因此，MhSGT1b基因及含有所述的MhSGT1b基因的重组表达载体可在创制耐低温新种质和/或植物品种改良中应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，涉及湖北海棠MhSGTlb基因的应用。
技术介绍
植物在生长过程中会遭遇多种逆境条件的胁迫，通过对植物抗逆反应的研究发现SGTl基因是植物抗病抗逆信号传递过程的重要调控基因。SGTl (suppressor of G2 alleleof Skpl)起先发现于酵母细胞，后来又发现存在于动物和ー些微生物中，不久前才发现植物中也存在与酵母同源的SGTl基因。酵母中SGTl是细胞周期抑制子Skpl的等位基因，它和Skpl 一祥，其蛋白能作用于细胞周期中G1/S和G2/S间期(Kitagawa et al.，1999)。Azevedo等(2002)发现在拟南芥中存在两种不同形式的SGTl :SGTla和SGTlb，但只有SGTlb在传导防卫信号过程中有重要作用(Azevedo et al. , 2002 ；Austin et al. , 2002 ； Tor et al. , 2002) 0并且与酵母中的作用不同，拟南芥SGTlb突变体并不表现有丝分裂的不规则性，SGTlb突变体也可以成活，这可能是因为SGTla能够补偿SGTlb的功能，在非允许生长温度下，拟南芥AtSGTla与AtSGTlb能够弥补酵母温度敏感SGTlb突变体的功能。然而对果树中的SGTla和SGTlb却少有报道，而苹果中的SGTlb尚未见报道，对它们的相互关系也有待进一步研究。果树生命周期长，生长发育过程中常受到多种环境胁迫影响，面对不断恶化的生态环境，为从根本上解决低温、干旱和盐碱等非生物胁迫对果树生长发育的不良影响，培育抗逆性强的果树品种是中国果树育种研究的ー个重要方向。但由于果树童期长、自交不亲和、杂合程度高等原因，通过常规杂交育种对其改良相当困难，而采用遗传转化的手段则可克服上述缺点，打破生殖隔离，在向现有品种引进期望性状的同时，不会出现基因的大量重组，也避开了童期的干扰。如转SOD基因的葡萄和转CBFl基因的草莓在田间试验中均表现出比未转化植株具有更强的抗冷能力(Christopher OL et al.，2002),通过促进甜菜碱或山梨醇的积累也获得了抗盐的转基因柿和草莓植株(Gao M et al. , 2000,2001 ;刘凤华等，1997)，Cervera等(2000)将酵母HAL2基因导入柑橘也获得了抗盐植株。柑橘在冷胁迫条件下会产生大量こ烯，导致叶片脱落，严重影响了植株的生长和发育。香港大学的Wong等(2001)从冷诱导的柑橘中分离出ACC合成酶基因(CS-ACSl)并将其反义导入甜橙和枳，转化植株经冷激后产生大量反义RNA，与此同时ACC含量升高受到抑制，こ烯生成减少，消除了冷诱导こ烯对果实留树和贮藏的不利影响。总体来看，中国果树转基因研究已经进入国际先进行列，在抗病、抗虫、抗逆性等转基因研究領域已经取得了重要进展，但是对于中国未来转基因果树研究影响最大的是中国克隆的具有自主知识产权的功能基因较少，往往是ー个基因在十几个物种中开展遗传转化；此外遗传转化效率较低，也在一定程度上制约了中国转基因果树研究取得更大进展。因此，当前的研究重点应放在利用中国丰富的果树种质资源克隆果树自身重要功能基因，提高基因转化效率以及开发转基因新技术上。‘湖北海棠’[Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.]是中国特有的种质资源，由于其抗逆性较强，被广泛用作苹果砧木。从湖北海棠上克隆相关抗逆基因导入苹果，因两者具有较高同源性故可提高其转化效率，开发具有中国自主知识产权的果树抗逆基因。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供‘湖北海棠’ MhSGTlb基因的应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现GenBank登录号为⑶183101的MhSGTlb基因在创制耐低温新种质和/或植物品种改良中的应用。含有所述的MhSGTlb基因的重组表达载体在创制耐低温新种质和/或植物品种改良中的应用。 其中，所述的含有MhSGTlb基因的重组表达载体优选将所述的MhSGTlb基因插入到pCAMBIA-S1300+载体的SpeI和KpnI酶切微点之间所得。有益效果本专利技术首次提供了从‘湖北海棠’克隆得到的MhSGTlb基因的应用。受低温胁迫的诱导，MhSGTlb在植物中过量表达；在植物受到低温胁迫吋，过量表达的MhSGTlb可诱导NtRbohD基因在植株中高水平表达、增强NtPINl基因和NtSOD基因表达、短暂增强NtSPS的表达水平，从而共同抵御胁迫。MhSGTlb转基因烟草具有较强的抵御低温胁迫的能力，植株可在4°C低温条件下正常生长长达24h，同时也证明了 MhSGTlb基因具有提高植物抗寒能力的功能。附图说明图I转MhSGTlb基因烟草PCR检测其中M表示marker，WT表示非转基因对照植株，H2O表示阴性对照(水)，P表示阳性对照(质粒)，B1-B16表示MhSGTlb转基因烟草株系图2转MhSGTlb基因烟草RT-PCR检测其中M表示marker，WT表示非转基因对照植株，H2O表示阴性对照(水)，P表示阳性对照(质粒)，B1-B7表示MhSGTlb转基因烟草株系图3 4°C处理不同时间后转基因烟草及野生型烟草的表型观察。图4转基因烟草中4°C处理不同时间后MhSGTlb基因的表达差异。图5野生烟草(WT)和转基因烟草(MhSGTlb) 4°C处理不同时间后NtRbohD基因的表达差异其中，WT表示野生型烟草，MhSGTlb表示转MhSGTlb基因烟草。图6野生烟草(WT)和转基因烟草(MhSGTlb)4°C处理不同时间后NtPINl基因的表达差异其中，WT表示野生型烟草，MhSGTlb表示转MhSGTlb基因烟草。图7野生烟草(WT)和转基因烟草(MhSGTlb) 4°C处理不同时间后NtSPS基因的表达差异其中，WT表示野生型烟草，MhSGTlb表示转MhSGTlb基因烟草。图8野生烟草(WT)和转基因烟草(MhSGTlb) 4°C处理不同时间后NtSOD基因的表达差异其中，WT表示野生型烟草，MhSGTlb表示转MhSGTlb基因烟草。具体实施例方式实施例I取‘湖北海棠’组培苗叶片，參考蔡斌华等改进的CTAB法(蔡斌华，张计育，高志红，渠慎春，佟兆国，靡林，乔玉山，章镇.ー种改良的提取草莓属叶片总RNA的方法[J].江苏农业学报，2008，24 (6) :875-877)提取RNA，反转录以及ds DNA的合成參考SMART PCRcDNA Synthesis Kit User Manual进行。根究已经报道物种的序列,在SGTl最大开放阅读框两端分别设计引物 sgtl-F :ACTAGTATGGCTTCCGATCTCG (SEQ ID NO. 2)及引物 sgtl-R :CGGTACCCTAGAACTCCCATT(SEQ ID NO. 3)。反应体系为 ds DNA 模板，I y L ; 10XPCRBuffer， 2.5 ;上游引物 sgtl-F、下游引物 sgtl-R 各 I ii L，MgCl2,1.5uL, dNTP, 2 u L, rTaq,0.125 u L,其余用水补齐至 25ii し反应程序为 94°C，4min ;94 °C，30s，55 °C，45s，72 °C，lmin本文档来自技高网...

【技术保护点】
GenBank登录号为GU183101的MhSGT1b基因在创制耐低温新种质和/或植物品种改良中的应用。

【技术特征摘要】
1.GenBank登录号为⑶183101的MhSGTlb基因在创制耐低温新种质和/或植物品种改良中的应用。2.含有所述的MhSGTlb基因的重组表达载体在创制耐低温新种质和/或植物品种改良中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：渠慎春，李春霞，吕东，张计育，乔玉山，章镇，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：