一种优化的拟南芥糖基转移酶基因及其在制备异槲皮素中的应用，核苷酸序列如SEQ NO:3所示。本发明专利技术所用的糖基转移酶专一性高，可以特异性转化槲皮素生成异槲皮素，所提供的异槲皮素生产方法简单，所得的异槲皮素纯度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及。
技术介绍
黄酮类化合物广泛存在于银杏、槐米、沙棘、桉树、黄芩等多种植物中，具有广泛的药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗过敏、抗菌、免疫调节和保护心血管等功效。研宄表明，与芦丁、槲皮素相比，异槲皮素(槲皮素-3-0-葡萄糖苷)在多个方面具有更强的生物活性。如异槲皮素在抑制恶性肿瘤增殖活性、抑制HIV-1和HSV-1/2的活性等方面均优于芦丁和槲皮素，在抑制乙酰胆碱酯酶活性方面优于槲皮素。因而，异槲皮素在抗癌、抗阿尔兹海默症、抗HIV等方面具有巨大的应用潜力。其次，异槲皮素具有更好的生物利用度。异槲皮素有着适宜的分子极性，相比槲皮素具有更好的水溶性，相比芦丁具有更高的肠上皮吸收率。Duenas和Makino等比较了槲皮素及其糖苷经口服给药在大鼠体内的生物利用度，结果显示异槲皮素的生物利用度显著高于槲皮素及芦丁。至目前为止，异槲皮素是唯一被FDA批准作为安全可供食用的食品添加剂。显然，异槲皮素在食品、保健品领域具有广阔的应用前景，也成为新药研宄的热点。目前制备异槲皮素主要通过提取分离和芦丁降解。专利技术专利(公开号:CN1355797A)公开了一种从生物类黄酮中回收异槲皮素的方法，但异槲皮素天然平均含量很低，通过提取分离手段制备难度大、产率低、成本高。专利技术专利(授权公告:CN 1261585C)公开了一种酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，但获得的是异槲皮素和槲皮素的混合物。利用转糖基酶以槲皮素为底物，通过转糖基反应生成异槲皮素是有效的方法(图1)，但转糖基酶可以在槲皮素的3位，5位，7位，3’位和4’位任何一个或多个位置转糖基，生产多种糖基化槲皮素。如何选择合适的转糖基酶，专一性的在3位添加葡萄糖基是研宄的关键问题。本专利技术是利用来源于拟南芥的转糖基酶，并对该酶基因按照大肠杆菌的优势密码子进行优化，克隆表达，构建重组基因工程菌，利用该工程菌转化槲皮素生成异槲皮素，并通过乙酸乙酯抽提，获得纯度达到99.9% (HPLC)的异槲皮素。
技术实现思路
解决的技术问题:本专利技术提供了，利用重组大肠杆菌所携带的重组质粒能高效表达转糖基酶AP73B3，该转糖基酶能特异性的转化槲皮素生产异槲皮素。技术方案:优化的拟南芥糖基转移酶基因，核苷酸序列如SEQ NO: 3所示。包含上述优化的拟南芥糖基转移酶基因的重组质粒。一种重组大肠杆菌，由上述的重组质粒转化大肠杆菌BL21 DE3而得。上述优化的拟南芥糖基转移酶基因在制备异槲皮素中应用。上述重组大肠杆菌在异槲皮素制备中的应用。上述重组大肠杆菌制备异槲皮素的具体方法为:将重组大肠杆菌以体积比1%的接种量接种于LB培养基中，30°C培养0D_至0.8，添加诱导剂IPTG至0.2 mM，葡萄糖至2wt.%，槲皮素至0.5 g/L，20°C，160 rpm全细胞转化36 h ;将上述转化液离心，取上清，加入I倍体积的乙酸乙酯抽提2次，得异槲皮素。有益效果:1.本专利技术所用的糖基转移酶专一性高，可以特异性转化槲皮素生成异槲皮素。2.本专利技术所述的异槲皮素生产方法简单，所得的异槲皮素纯度高。【附图说明】图1槲皮素和异槲皮素结构示意图； 图2转化条件对重组菌生成异槲皮素的影响a:诱导剂IPTG用量对重组菌转化槲皮素生成异槲皮素的影响；b:转化温度对重组菌转化槲皮素生成异槲皮素的影响；c:葡萄糖浓度对重组菌转化槲皮素生成异槲皮素的影响； 图3为实施例3的槲皮素和异槲皮素的高效液相图谱A:槲皮素的标样:异槲皮素的标样；C:重组菌产异槲皮素的高效液相图谱。【具体实施方式】下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术进行详细阐述，其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。实施例1: 1.重组质粒PGEX-2T-0PAP73B3的构建 1.1拟南芥糖基转移酶基因似的优化 参考NCBI已经发布的拟南芥UrahWoASi1S糖基转移酶73B3 (AP 73B3)的cDNA序列，得到糖基转移酶AP 73B3的核苷酸序列信息，如SEQ NO:1所示，氨基酸序列如SEQ NO:2所示。按照大肠杆菌K12优势密码子表(http://www.kazusa.0r.jp/codon/)对糖基转移酶AP 73B3的基因序列进行优化，选择氨基酸同义密码子使用频率高的密码子作为优势密码子，最终获得优化后的拟南芥糖基转移酶基因(opap73B3、序列信息，如SEQNO:3所示，获得序列信息后，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，获得优化后的拟南芥糖基转移酶基因似，氨基酸序列如SEQ NO:4所示。1.2 重组质粒 PGEX-2T-0PAP73B3 的构建按照优化后的拟南芥糖基转移酶基因OA3/77JA5序列设计引物。引物序列如SEQ NO:5和SEQ N0:6所示；以合成的拟南芥糖基转移酶基因似为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95°C，5 min ;暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40 μ L石錯油密封；35 次循环(94°C，50 s;51°C，90 s;72°C，1.0 min );72°C，10 min ;反应停止，4°C保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，得到优化后的拟南芥糖基转移酶基因opap73B3o得到优化后的拟南芥糖基转移酶基因opeip73B:m pGEX_2T分别用BamH I和EcoRI双酶切，并分别割胶回收，16°C过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌ToplOF’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得拟南芥糖基转移酶基因核苷酸序列的重组质粒PGEX-2T-0PAP73B3。2.重组菌生成异槲皮素的转化条件研宄 2.1槲皮素及异槲皮素的测定 槲皮素及异槲皮素的测定采用HPLC方法测定，HPLC测定的条件为:Agilent 1260Infinity ;DAD检测器检测波长为368 nm，柱温为40°C，流动相流速为0.8 mL/min (A:甲醇，B: 1% 甲酸水；0 min, A:B 为 50:50 ；12 min, A:B 为 62:38 ；25 min, A:B 为 50:50.) 2.2诱导剂IPTG用量对重组菌转化槲皮素生成异槲皮素的影响将重组质粒PGEX-2T-0PAP73B3转化大肠杆菌BL21 (DE3)，挑单菌落到LB试管过夜培养，将该菌以体积比1%接种量接种于LB培养基中，30°C培养0D_至0.8，添加诱导剂IPTG分别为0，0.05，0.1，0.2，0.4和 0.8 mM，槲皮素至0.5 g/L，30°C，160 rpm全细胞转化36 h，分别测定转化率，结果发现0.2 mM IPTG转化率最高。2.3葡萄糖浓度对重组菌转化槲皮素生成异槲皮素的影响 将重组质粒PGEX-2T-0PAP73B3本文档来自技高网...
【技术保护点】
优化的拟南芥糖基转移酶基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ NO:3所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：裴建军，赵林果，董萍，吴涛，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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