一种单双酰脂肪酶、其编码基因及应用制造技术

本发明专利技术提供了一个新的单双酰脂肪酶Ｍｄｌ（９）以及编码该酶的基因ｍｄｌ（９），该酶的氨基酸序列如ＳＥＱ?ＩＤ?Ｎｏ．２所示，编码该酶基因的核苷酸序列如ＳＥＱ?ＩＤ?Ｎｏ．１所示。实验表明，单双酰脂肪酶Ｍｄｌ（９）具有较高的水解单酰甘油酯和二酰甘油酯的活力。本发明专利技术还提供其在巴斯德毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ?ｐａｓｔｏｒｉｓ）中的分泌表达载体和高效表达该酶的方法。采用该方法，表达的单双酰脂肪酶能有效地分泌到胞外，不仅降低了分离纯化成本，而且表达效率提高。在摇瓶培养的条件下，以甲醇为诱导物进行诱导培养时，胞外分泌量可达６６０ｍｇ／Ｌ，以单硬脂酸甘油酯为底物，酶活达到２７００Ｕ／ｍｌ。本发明专利技术为该酶的工业化应用奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉生物
，具体地涉及一种脂肪酶，编码该脂肪酶的基因以及该酶 的应用。本专利技术还涉及一种异源表达该单双酰脂肪酶的方法。
技术介绍
目前，酶法催化化学反应因为其反应条件温和，副产物少而逐渐替代繁琐、昂贵的化学法。脂肪酶(E C3. 1. 1. 3)是一类具有多种催化能力的酶，因为其可以催化水解、醇解、 酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应等多种化学反应，而成为一种重要的工业用酶，应用在 生产、生活中的很多方面。脂肪酶的应用主要包括，在面粉行业是满足于各种面粉改良剂功能需求的首选 酶制剂之一；食品增香通过对原料中的脂肪酸的分解，转化成具有特殊香气的物质，增加 产品风味；鱼片加工用碱性脂肪酶脱去了鱼片中大量的油脂，使鱼片的保鲜、口味及色泽 都有显著的提高，彻底解决碱法脱脂影响鱼片质量的难题；在洗衣粉中的应用在洗衣粉 配方中加入适量的碱性脂肪酶，并与碱性蛋白酶配伍成复合酶，不仅可以明显提高洗衣粉 的去污力，而且对洗涤织物的保养，抗再污染等方面有显著效果；在皮革脱脂方面碱性脂 肪酶的专一性确保了脱脂后的皮革质量在诸多方面有明显的提高，是生产高档皮革的首选 脱脂剂，而且有助于提高皮革的等级率及解决环境污染问题；在造纸行业克服马尾松磨 木浆的树脂障碍、漂白助剂、废纸张浆的油墨脱除、造纸网毯的清洗及纸厂废水处理等方面 都有显著功效。目前有越来越多的微生物来源的脂肪酶被开发出来，因为其性质的不同而 在不同领域中发挥着重大的作用。单双酰脂肪酶是脂肪酶的一种，它主要以二酰甘油和单酰甘油为底物，在工业上 也有十分广泛的应用，另外由于其在性质上与三酰甘油脂肪酶的互补性，还将它和三酰脂 肪酶组合起来使用，可以大大提高三酰甘油的水解及转酯化效率。目前，已知的单双酰脂肪酶数量极少，酶活普遍不高，限制了其应用。因此寻找新 的具有高活性的单双酰脂肪酶，建立其高效表达体系是本领域亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种单双酰脂肪酶；本专利技术的第二个目的在于提供编码上述单双酰脂肪酶的基因；本专利技术的第三个目的在于提供一种可在巴斯德毕赤酵母中分泌表达单双酰脂肪 酶的表达载体；本专利技术的第四个目的在于提供上述单双酰脂肪酶的用途。本专利技术从圆弧青霉(Penicillium cyclopium)菌株中克隆到一个新的单双酰脂肪 酶(mono-and diacylglycerol lipase, MDL)基因 mdl(9)，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 所 示，该基因全长为840bp，分析表明，GC含量为56. 1 %，编码279个氨基酸组成的蛋白。由3该基因编码的单双酰脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。该蛋白大小约39kD，活性 中心是145位Ser，199位Asp和259位His。实验表明由该基因编码的单双酰脂肪酶具有 较高的酶活。通过酶学性质测定，该酶的最适反应温度为45°C，最适反应pH值为6. 0，在中 性偏碱性条件下稳定。为便于表述，将该单双酰脂肪酶命名为Mdl⑼。应当理解，本领域技术人员可根据本专利技术公开的单双酰脂肪酶的氨基酸序列(SEQ ID No. 2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋 白的突变序列。例如在非活性区段，将第25位的Asp替换为Ala。因此，本专利技术单双酰脂肪 酶还包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与 Mdl⑼同等活性的由Mdl⑼衍生得到的蛋白质。本专利技术基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术 人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本专利技术单双酰脂肪酶基因还包 括由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码 Mdl(9)的核苷酸序列。可将本专利技术基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本专利技术蛋白的重组表达 载体，进一步将该重组表达载体导入恰当的宿主细胞中，获得表达本专利技术Mdl⑼的基因工程 菌。在本专利技术实例中，通过将单双酰脂肪酶基因mdl⑼插入到巴斯德毕赤酵母表达载 体PPIC9K上构建得到在巴斯德毕赤酵母中的表达载体pPIC9K-mdl⑼，其质粒图谱如附图2 所示。进一步，将该表达载体导入到巴斯德毕赤酵母中获得表达Mdl⑼的基因工程菌。本专利技术还提供一种制备上述Mdl⑼的方法，其是通过培养上述基因工程菌，经诱导 表达获得单双酰脂肪酶Mdl(9)。所述培养条件为28°C，初始pH为7，200rpm培养120-170 小时。所述诱导条件为每24小时补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0%。采用该方 法，摇瓶培养148小时，分泌到胞外的酶量可达660mg/L，以单硬脂酸甘油酯为底物，酶活为 2700U/ml。本专利技术提供的单双酰脂肪酶，具有较高的酶活性，增加了单双酰脂肪酶的成员。本 专利技术通过构建恰当的表达载体，使所述单双酰脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中分泌表达， 表达的单双酰脂肪酶大部分分泌到细胞外，降低了分离纯化成本，而且表达效率较高，在摇 瓶培养的条件下，以甲醇诱导培养时，胞外分泌酶量可达660mg/L，以单硬脂酸甘油酯为底 物，检测酶活可达2700U/ml。本专利技术为该酶的工业化应用奠定了基础。附图说明图1目的基因DNA酶切回收电泳图，泳道1为DNA标准分子量(kb) :4. 5，3. 0，2. 0， 1. 2,0. 8,0. 50. 2 ；泳道2 目的基因DNA酶切回收840bp片段(箭头所指)；图2表达质粒pPIC9K-mdl(9)构建流程图；图3表达质粒pPIC9K-mdl(9)的酶切电泳图，其中，泳道1为DNA标准分子量(kb) 4. 5,3. 0,2. 0,1. 2,0. 8,0. 50. 2 ；2 为质粒 pPIC9K_mdl(9)经 SnaBI 和 Not I 双酶切后的结果， 箭头所指为目的基因。图4毕赤酵母GS115-pPIC9K-mdl(9)摇瓶培养细胞密度及胞外酶活检测图。具体实施例方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离 本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本专利技术中涉及到的百分号“ ％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分 比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20°C时 容量的比例。所涉及的酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克 隆(第三版)》。引物合成及测序由英骏(Invitrogen)生物公司完成。实施例1圆弧青霉cDNA的制备1. 1圆弧青霉总RNA的提取(1)取适量的圆弧青霉菌丝，滤纸吸干水分，液氮研磨，加入lmlTrizol试剂 (Invitrogen)，振荡器振荡5min，室温静置lmin ；(2)加入0. 2ml氯仿，振荡15秒，静置2min ；(3) 4°C，12000rpm, 15min ；(4)吸取上清，加入等体积异丙醇，-20°C沉淀30min ；(5)4°C, 12000rpm, 15mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
单双酰脂肪酶Ｍｄｌ（９），其氨基酸序列为：　　ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２所示的氨基酸序列；　　ｂ）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２所示的氨基酸序列经替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
单双酰脂肪酶Mdl(9)，其氨基酸序列为a)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；b)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述单双酰脂肪酶Mdl⑼的基因。3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。5.如权利要求4所述的重组载体，其为pPIC9K-mdl(9)。6.权利要求4或5所述重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：李颖，关菲菲，王贵利，关国华，王珍芳，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]