本发明专利技术公开了一种转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括以下步骤：从青蒿中克隆青蒿中WRKY类转录因子AaWRKY1基因；构建含AaWRKY1基因的植物表达载体；用根癌农杆菌介导，将AaWRKY1基因转入青蒿并再生出植株；PCR检测外源目的基因AaWRKY1的整合情况；高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定转基因青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明专利技术提供的转AaWRKY1基因青蒿中青蒿素的含量达到24.59mg/g?DW，其含量是非转化青蒿含量的4.44倍，从而提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，为青蒿素的规模化生产提供了高产、稳定的新药源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用转基因技术提高青蒿中青蒿素含量的方法，特别是一种转AaffRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。
技术介绍
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半職内酯化合物,是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。 目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，不同种植环境和种植品种中其平均含量在青蒿叶片干重的0.01 1%，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0. 1%，在芽中最高也只有干重的0. 16%，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。经对现有技术文献检索发现，Ma等2009年在《Plant & Cell Physiology》(植物和细胞生理学)发表了题为 “Isolation and Characterization of AaffRKYI, anArtemisia annua Transcription Factor that Regulates the Amorpha—4， 11—dieneSynthase Gene, a Key Gene of Artemisinin Biosynthesis”(“调控青蒿素生物合成关键酶ADS的WRKY类转录因子AaWRKYl的分离和克隆”)的论文，报道通过酵母单杂和凝胶阻滞实验初步的验证了 AaWRKYl能够和ADS的启动子结合，并通过构建过量表达载体瞬时转青蒿，发现青蒿中青蒿素合成途径中的酶的表达都增加了。这说明AaWRKYl在青蒿素的合成中具有重要的作用。现有技术中青蒿WRKY类转录因子AaWRKYl能够调控青蒿素合成途径中的第一个关键酶ADS，是青蒿素代谢工程的重要元件。采用基因工程手段，用AaWRKYl基因转化青蒿，将打破青蒿素生物合成的限速瓶颈，获得青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供一条新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种转AaWRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本专利技术建立了稳定提高青蒿中青蒿素含量的方法，为青蒿素的规模化生广提供了闻广、稳定的新药源。本专利技术的目的通过以下技术方案实现一种转AaWRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下步骤步骤一，采用基因克隆方法获得青蒿WRKY类转录因子AaWRKYl基因；步骤二，把所述AaWRKYl基因连结于表达调控序列，构建含AaWRKYl基因的植物表达载体；步骤三，将所述含AaWRKYl基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含所述AaWRKYl基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；步骤四，利用所述构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的整合外源目的基因AaWRKYl基因的转基因青蒿植株；步骤五，对所述转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。优选的，在所述步骤四中，所述转化包括以下步骤外植体的预培养；农杆菌与外植体的共培养；抗性再生植株的筛选。 优选的，所述预培养包括以下步骤青蒿种子用75%乙醇浸泡lmin,再用20%NaC10浸泡20min,无菌水冲洗3 4次,用无菌吸水纸吸干表面水分,接种于无激素的MS固体培养基中，25°C光照培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。优选的，所述共培养包括以下步骤将所述叶片外植体转到共培养培养基中，滴加含活化的所述含AaWRKYl基因植物表达载体的根癌农杆菌的1/2MS悬液，使所述外植体与所述悬液充分接触，28°C暗培养3天，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。优选的，所述筛选包括以下步骤将所述共培养3天的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基上于25°C光照培养，每两周继代培养一次，经过2 3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将所述生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基上培养至生根，即可获得Kan抗性再生青蒿植株。优选的，在所述步骤四中，所述PCR检测包括以下步骤设计合成AaWRKYl基因的引物；进行DNA扩增；紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株。优选的，在所述步骤五中，所述HPLC-ELSD测定包括以下条件色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇/K，甲醇水的体积比为70:30，柱温301，流速I. OmL/min，进样量为20 u L，蒸发光散射检测器漂移管温度40°C，放大系数为7，载气压力5bar。本专利技术从青蒿中克隆AaWRKYl基因，构建含AaWRKYl基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将AaWRKYl基因导入青蒿并再生出植株；PCR检测外源目的基因AaWRKYl的整合情况，HPLC-ELSD测定青蒿中青蒿素含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本专利技术提供的转基因青蒿株系的青蒿素含量显著提高，转AaWRKYl基因青蒿中青蒿素的含量最高可达到干重的24. 59mg/g,是非转化普通青蒿的4. 44倍，为青蒿素的规模化生产提供了高产、稳定的新药源。附图说明图I为本专利技术提供的转基因青蒿株中青蒿素的含量检测结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I 青蒿AaWRKYl基因的克隆I. I青蒿基因组总RNA的提取取100-200mg青蒿幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有ImLTRlzol (TRlzol Reagents, GIBCOBRL, USA)的 I. 5mL Eppendorf 管中，充分振荡后，于室温下放置5min,加200 u L氯仿，用力振荡15sec,室温放置2 3min后，于4°C下12, OOOrmp离心15min ;将上清液(约600 u L)吸入干净的I. 5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混勻，室温下放置IOmin后，于4°C下12，OOOrmp离心IOmin ;弃上清,加lmL75%乙醇清洗，振荡后，于4°C下7，500rmp离心5min ;室温干燥10 15min后溶于适本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，采用基因克隆方法获得青蒿WRKY类转录因子AaWRKY1基因；步骤二，把所述AaWRKY1基因连结于表达调控序列，构建含AaWRKY1基因的植物表达载体；步骤三，将所述含AaWRKY1基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含所述AaWRKY1基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；步骤四，利用所述构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的整合外源目的基因AaWRKY1基因的转基因青蒿植株；步骤五，对所述转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC？ELSD测定，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。
【技术特征摘要】
1.一种转AaWRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤 步骤一，采用基因克隆方法获得青蒿WRKY类转录因子AaWRKYl基因； 步骤二，把所述AaWRKYl基因连结于表达调控序列，构建含AaWRKYl基因的植物表达载体； 步骤三，将所述含AaWRKYl基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含所述AaWRKYl基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株； 步骤四，利用所述构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的整合外源目的基因AaWRKYl基因的转基因青蒿植株； 步骤五，对所述转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。2.根据权利要求I所述的转AaWRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，在所述步骤四中，所述转化包括以下步骤外植体的预培养；农杆菌与外植体的共培养；抗性再生植株的筛选。3.根据权利要求2所述的转AaWRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述预培养包括以下步骤青蒿种子用体积分数为75%乙醇浸泡lmin，再用质量分数为20%NaC10浸泡20min,无菌水冲洗3 4次,用无菌吸水纸吸干表面水分,接种于无激素的MS固体培养基中，25°C光照培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。4.根据权利要求2所述的转AaWRKYl基...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，江伟民，陆续，邱波，王国丰，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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