包含纳米管的流体流动装置及其用于细胞迁移的方法制造方法及图纸

本发明专利技术涉及用于细胞迁移的装置及方法。特别地，本发明专利技术涉及流动表面上固定有纳米管的流体流动装置。纳米管的外表面具有支持细胞滚动的分子。同时提供从混有不同细胞类型的混合物或从流体中分离一种细胞类型的方法，所述方法基于各种细胞类型在流动表面上滚动性质的差异。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及细胞分离的装置及方法。特别地，本专利技术涉及从混有不同细胞类型的混合物中或从流体中分离选定的细胞类型，所述分离基于细胞在涂覆有支持细胞滚动的细胞粘附分子的基底上的滚动能力。
技术介绍
纯化细胞群在生物医学研究及临床治疗领域具有多种应用。通常，可根据细胞间不同的尺寸、密度或电荷对其进行分离。然而，对于具有相似物理性质的细胞，经常通过利用细胞表面上存在的分子的差异对其进行分离。细胞亲和层析法就是基于该途径，主要利用针对细胞表面特定抗原的固定的抗体。该亲和层析分离法需要若干不同的步骤，包括将细胞与抗体共同孵育、细胞洗脱、细胞收集及结合抗体的释放，每个步骤都会降低细胞的总收率并增加工艺成本。还需要从富含所需生物学靶点的供体中获得细胞样品。因为异质样品可能仅包含极少量的所需生物实体，经常无法通过分离方法来提供研究、诊断或治疗用途所需的具有足够纯度及数量的有活力及效力的生物学靶点。由于分离及纯化后的收率较低，必须将一些细胞类型，如干细胞、祖细胞以及免疫细胞(特别是T-细胞)置于长期培养系统中，所述长期培养系统中的条件确保维持细胞活力及临床效力，并且在所述条件下细胞可增殖(细胞扩增)。这些条件不一定都是现有存在的。为获得足够量的生物学靶点，必须从供体中一次性获取大量的样本，如外周血；或从一个供体中多次提取样本，然后进行一次或多次冗长、昂贵及通常收率较低的分离步骤以实现生物学靶点的有效分离。综上所述，这些问题给供体、分离方法、技术人员、临床医师及病人产生了显著的负担，这些负担显著增加了分离所需细胞的所需要的时间及费用。因此，以连续、流动方式分离/隔离细胞的方法及装置的需求始终存在。专利技术概述本专利技术提供一种用于细胞迁移的装置及方法，所述装置及方法使细胞在拓扑结构已被纳米管改变的流动表面上进行流动，所述纳米管的外表面附着有支持细胞滚动的细胞粘附分子。利用不同细胞类型在该表面上滚动速度的差异可分离不同的细胞群。本专利技术装置具有用于细胞滚动的表面。该表面可以是流体流动腔的一部分。在表面上布置有纳米管，以使纳米管固定在所述表面上。该纳米管又涂覆有支持细胞滚动的细胞粘附分子。在一个实施例中，在已固定有纳米管的表面上具有包含正电荷分子组合物(如聚赖氨酸)的涂层。本专利技术同时提供一种制备装置的方法，所述装置具有改变的拓扑结构以支持细胞的差异性滚动，从而实现所述细胞的分离、隔离和/或纯化。该方法包括获得具有流动表面的流体流动腔。在其外表面已附着有纳米管，然后在流动表面上直接布置细胞粘附分子，或用包含正电荷分子(如聚赖氨酸)的组合物进行涂覆后，再布置细胞粘附分子。在一个实施例中，可将纳米管布置在流动表面上，然后用细胞粘附分子涂覆纳米管。本专利技术的装置也用于富集、分离、隔离和/或纯化细胞。该方法包括让包含细胞或细胞混合物的流体组合物沿所述表面流动。由于特定细胞与涂覆的表面间发生粘附，导致不同细胞类型以不同速度滚动，因此可从其他细胞中分离、富集或纯化出特定细胞。附图简述图I.在生理学剪切力范围内，KGla细胞在涂覆有多水高岭土纳米管的表面上的平均滚动速度降低。P-选择素以2. g/mL的浓度孵育(A)。在较低⑶或较高(C)剪切力下，KGla细胞的平均滚动速度作为P-选择素孵育浓度的函数。误差以SEM表示(N = 3)，***P < 0. 001，**P < 0. 01，*P < 0. 05。图2.在对照表面(A)及涂覆有纳米管的表面(B)上，细胞滚动的代表性显微照片中可观察到被捕获的细胞数目显著增加。单位面积表面中被捕获的KGla细胞数目作为在较低(C)或较高⑶剪切力下选择素孵育浓度的函数。误差以SEM表示(N = 3)，***P< 0. 001。图3.微型管内表面上的多水高岭土纳米管涂覆层增强Colo205上皮癌细胞的捕获，通过滚动速度(A)及单位面积导管表面所捕获的细胞数目(B)进行定量。误差以SEM表示(N= 3),***P < 0. OOl0图4.与分散于培养基中的纳米管孵育72h后，KGla (A)或Colo205(B)细胞的存活未受影响。“经处理”条代表在10%多水高岭土纳米管与90%培养基中培养的细胞的平均存活性，而“未处理”条代表在10%蒸馏水与90%培养基中培养的细胞的平均存活性。误差以SEM表示(N = 3)。图5.假设(hypothesized)的纳米级表面拓扑结构图示,其中单个纳米管竖立在表面外，并在细胞沉积于表面时促进早期的细胞捕获(A)。在破碎处理并除去大的聚集物处理之后(B)及之前(C)，固定在表面上的多水高岭土纳米管的代表性原子力显微镜图像。需要通过该处理步骤，产生重现性更高的细胞粘附行为。图6.在P-选择素孵育溶液一定浓度范围内，比较涂覆有纳米管的表面及对照表面的免疫荧光(A)。涂覆有多水高岭土的导管(B)及对照导管(C)都与10 u g/mL的P-选择素进行孵育，获得代表性的显微图像。误差以SEM表示，***P < 0. 001。图7.在50cm涂覆有纳米管的导管及对照导管中保持恒定的压差值，并计算通过每种类型导管的所得流速。通过改变流体容器相对于导管出口的高度，获得不同的压差，并将结果与不具有可调参数的理论值进行比较(A)。将荧光微球灌注通过导管，并测定接近导管表面的微球速度作为流速的函数。从AFM数据中，确定最大表面粗糙度高度，发现纳米管涂覆层上的平均最大值是505nm，而空白对照表面上的平均最大值是30nm。通过方程式1，计算表面-表面分离距离(5)为505nm及30nm时的微球理论速度，发现其与不具有可调参数的实验观察值相匹配(B)。AFM图像中代表性的表面特征。为便于观察，将纳米管涂覆层的曲线上移IOOnm(C)。误差以SEM表示，***P < 0. 001。图8.采用与其他滚动实验相同的方式制备导管，然后与用于封闭的抗P-选择素抗体进行孵育。在对照导管或纳米管涂覆导管中均只出现极少量的细胞粘附。图9.在另一组实验中，制备用于滚动实验的涂覆有纳米管的导管及对照导管，允许细胞发生粘附及滚动。随后引入EDTA，以螯合溶液中的所有二价离子，从而使P-选择素失活。在轻柔洗涤导管以除去所有未结合细胞后，在导管中未观察到保持粘附的细胞。附图说明图10.当P-选择素浓度低于2. 5 u g/mL时观察到细胞捕获急剧下降。优选实施例的详细描述本专利技术提供用于细胞迁移的装置及方法，基于细胞滚动速度的差异，从而分离细胞群。本专利技术源自这样的发现，使细胞流动通过流体腔可增强基于细胞滚动的细胞迁移，所述流体腔表面的拓扑结构已被固定的纳米管所改变，其中纳米管采用支持细胞滚动的细胞粘附分子进行功能化。纳米管的存在可显著改变细胞的平均滚动速度，从而使流过腔体的流体中的多种细胞得到分离。至少部分增强效应被认为归因于那些伸出表面并伸进流动流体中的纳米管。本专利技术中，通过使用原子力显微镜检查及免疫荧光定量技术获得的数据支持该模型。因此，虽然所述纳米管几乎不影响宏观流体动力学，但却改变了对流颗粒或细胞 的平衡流线。基于这些发现，本专利技术提供用于细胞迁移的装置及方法。本专利技术装置包含流体流动腔(本专利技术中也被称为微型管)，其中所述流动腔的内表面上固定有纳米管。纳米管的外表面上载有支持细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.10.08 US 61/249,8711.一种用于细胞迁移的方法，所述方法包括以下步骤 a)提供其上固定有纳米管的表面，所述纳米管选自多水高岭土、二氧化硅及氧化钛，且所述纳米管的外表面固定有细胞粘附分子；以及 b)在所述表面上流动包含细胞混合物的流体，其中，与细胞表面不表达细胞粘附分子的配体的细胞相比，在细胞表面表达细胞粘附分子的配体的细胞呈现滚动并因此以不同的速度进行流动，从而允许将表达配体的细胞与不表达配体的细胞分离。2.根据权利要求I所述的方法，其中所述细胞粘附分子选自由选择素、钙粘素、整合素和GPlb，及其片段。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述选择素选自由P-选择素、L-选择素及E-选择素。4.根据权利要求I所述的方法，其中所述流动装置的内径介于10-500微米以促进靶细胞朝着装置表面靠边(margination)。5.根据权利要求I所述的方法，其中所述细胞混合物中的一种细胞是干细胞或癌细胞。6.根据权利要求I所述的方法，其中步骤b)包括使细胞承受0.5至10dynes/cm2的剪切力。7.根据权利要求I所述的方法，其中所述纳米管是多水高岭土纳米管，且多数纳米管具有500至1200nm的长度及40至200nm的直径。8.一种用于细胞迁移的装置，所述装置包含内表面上固定有纳米管的流体流动腔，所述纳米管选自...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·R·金，安德鲁·休斯，
申请(专利权)人：康奈尔大学，
类型：发明
国别省市：