本文描述了用于将载荷(cargo)递送到所靶向组织和细胞的工程化胞外囊泡的组合物。本文还描述了用于制备和使用本文所描述的胞外囊泡的方法。最后，本文描述了用于治疗对象的方法，所述方法包括向对象施用如本文所描述的胞外囊泡。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、精确地将诊断剂或治疗剂施用于所关注部位一直是一个挑战。目前，两种主要类型的基因疗法递送系统是病毒和非病毒的(y.k.sung和s.w.kim,《生物材料研究(biomaterres)》23,8(2019)；n.nayerossadat等人,《先进的生物医学研究(adv biomed res)》1,27(2012))。对于病毒载体，尽管非常有效，但安全性是主要关注点。非病毒载剂，包含聚合复合物和脂质体，具体地脂质纳米颗粒(lnp)，通常缺乏靶向特异性。由于胞外囊泡(extracellular vesicles，ev)具有生物相容性、介导细胞间分子交换的内源性功能以及靶向特定组织和穿过血脑屏障(bbb)的天然能力，近年来的研究越来越关注ev作为一类新的有前景的rna药物递送载剂(tang等人,《肿瘤学前沿(front oncol)》9,1208(2019)；aslan等人,《bmc生物技术(bmc biotechnol)》21,20(2021)；ridder等人,《公共科学图书馆·生物学(plos biol)》12,e1001874(2014)；haney等人,《控制释放杂志(j controlrelease)》207,18-30(2015)；alvarez-erviti等人,《自然·生物技术(nat biotechnol)》29,341-345(2011)；andras和toborek,《组织屏障(tissue barriers)》4,e1131804(2016)；van niel等人,《自然综述·分子细胞生物学(nat rev mol cell biol)》19,213-228(2018))。然而，基于ev的疗法的临床转化受到缺乏对哪些分子从产生ev的供体细胞装载到ev中的控制的阻碍。根据供体细胞类型，ev的载荷(cargo)可以包含蛋白质、dna、rna、脂质、营养物和代谢废物。不需要的细胞组分不能从ev中排除，这不仅损害了装载能力，而且还将潜在的有害组分递送到靶标，如引入工程ev的过表达构建体和细胞废物。
2、已经开发了许多系统来将小rna载荷，如sirna和微小rna装载到ev中，但是ev中长mrna的主动富集仍然是一个挑战(aslan等人,《bmc生物技术》21,20(2021))。报告了极低拷贝数量的内源性ev相关rna，范围在0.02至1rna/ev，并且小rna比长mrna更高效地包装到ev中(0.01至1微小rna对0.001长完整rna/ev)(mosbach等人,《细胞(cells)》10,(2021)；m.li等人,《自然科学会报乙·生物科学(philos trans r soc lond b biol sci)》369,(2014)；chevillet等人,《美国国家科学院院刊(proc natl acad sci u s a)》111,14888-14893(2014)；z.wei等人,《自然·通讯(nat commun)》8,1145(2017))。在供体细胞中仅8％的mrna可以在它们的ev中检测到(h.valadi等人,《自然·细胞生物学(nat cell biol)》9,654-659(2007))。先前报告的将mrna装载到ev中的方法包含主动和被动包封(x.luan等人,《中国药理学学报(acta pharmacol sin)》38,754-763(2017))。例如，过氧化氢酶mrna通过在超声处理和挤压之后与巨噬细胞来源的ev一起温育或者用皂苷透化来装载以治疗帕金森氏病(parkinson's disease，pd)(haney等人,《控制释放杂志》207,18-30(2015))。为了治疗白血病，通过电穿孔将反义寡核苷酸(aso)、crispr-cas9 mrna和向导rna(grna)递送到源自去核红细胞(rbc)的ev中(w.m.usman等人,《自然·通讯》9,2359(2018))。还可以在亲本细胞水平上工程化ev，其中遗传组分被引入以指导设计的ev的产生，通常涉及载荷组分的极度过表达以达到足够的装载剂量。这些程序可能会破坏ev，导致其聚集，或者改变产生ev的供体细胞的生理，从而后续降低载荷装载(x.luan等人,《中国药理学学报》38,754-763(2017)；f.momen-heravi等人,《纳米医学(nanomedicine)》10,1517-1527(2014)；j.h.wang等人,《分子癌症治疗学(mol cancer ther)》17,1133-1142(2018))。
3、将核酸递送到细胞的可用方法具有明显的局限性。例如，经常用于基因疗法的aav病毒载体是免疫原性的，具有大约4.4kb的有限有效载荷容量，生物分布差，仅能通过直接注射施用，并且存在通过整合破坏宿主基因的风险。非病毒方法具有不同的局限性。脂质体主要递送到肝脏。胞外囊泡具有有限的可扩展性和纯化困难。因此，公认需要新的递送治疗有效载荷的方法。
4、大多数分子在体内不具有固有的亲和力。在其它情况下，所施用的药剂在肝脏和肾脏中积累以便清除，或者在非预期的组织或细胞类型中积累。用于改善递送的方法包含用疏水性化合物或聚合物包覆所选的药剂。此类方法增加了所述药剂在循环中的持续时间，并且增加了用于细胞摄取的疏水性。另一方面，此方法没有主动地将载荷引导到所关注位点以进行递送。
5、为了特异性靶向需要疗法的位点，治疗化合物任选地与如配体、抗体和适体等部分融合，所述部分识别展示在所靶向细胞的表面上的受体并与所述受体结合。在到达所关注细胞时，治疗化合物任选地被进一步递送到胞内靶标。例如，如果治疗性rna与细胞的细胞质中的核糖体接触，该治疗性rna可以被翻译成蛋白质。
技术实现思路
1、本公开涉及工程化的胞外囊泡、制备工程化的胞外囊泡的方法以及使用工程化的胞外囊泡将治疗化合物、生物制剂或两者递送到所关注组织和细胞的方法。
2、在第一方面，本公开涉及一种rna转录物组合物，其包含载荷mrna，所述载荷mrna包括arc 5’utr序列。在一些实施例中，所述rna转录物组合物进一步包含arc mrna。在一些实施例中，所述arc 5’utr序列包括来自哺乳动物的arc 5’utr序列。在一些实施例中，所述arc 5’utr序列包括选自由人、小鼠和大鼠组成的组的arc 5’utr序列。在一些实施例中，所述arc 5’utr序列包括来自果蝇属的arc 5’utr序列。在一些实施例中，所述arc 5’utr序列包括与seq id no:1-4中的任一个具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的arc5’utr序列。在一些实施例中，所述载荷mrna进一步包括poly(a)信号。在一些实施例中，所述载荷mrna编码治疗性蛋白。在一些实施例中，所述载荷mrna编码肽、酶、细胞因子、激素、生长因子、抗原、抗体、抗体的一部分、凝血因子、调节蛋白、信号传导本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种RNA转录物组合物，其包含载荷mRNA(cargo mRNA)，所述载荷mRNA包括Arc 5’UTR序列。
2.根据权利要求1所述的RNA转录物组合物，其进一步包含Arc mRNA。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述Arc 5’UTR序列包括来自哺乳动物的Arc5’UTR序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述Arc 5’UTR序列包括来自人、小鼠或大鼠的Arc 5’UTR序列。
5.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述Arc 5’UTR序列包括来自果蝇属(drosophila)的Arc 5’UTR序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述Arc 5’UTR序列包括与SEQ IDNO:1-4中的任一个具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述载荷mRNA进一步包括poly(A)信号。
>8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述载荷mRNA编码治疗性蛋白。9.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述载荷mRNA编码肽、酶、细胞因子、激素、生长因子、抗原、抗体、抗体的一部分、凝血因子、调节蛋白、信号传导蛋白、转录蛋白和/或受体。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述载荷mRNA编码荧光蛋白、生物发光蛋白和/或重组酶报告子(recombinase reporter)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述Arc mRNA包括Arc 3’UTR序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述Arc mRNA包括来自哺乳动物的Arc 3’UTR序列。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述哺乳动物是人、小鼠或大鼠。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述Arc 3’UTR序列包括来自果蝇属的Arc 3’UTR序列。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的组合物，其中所述Arc 3’UTR序列包括与SEQID NO:5-8中的任一个具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述Arc mRNA进一步包括poly(A)信号。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述Arc mRNA编码来自哺乳动物的Arc蛋白。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述哺乳动物是人、小鼠或大鼠。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述Arc mRNA编码来自果蝇属的Arc蛋白。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述Arc mRNA包括来自哺乳动物的Arc mRNA序列。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述哺乳动物是人、小鼠或大鼠。
22.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述Arc mRNA包括来自果蝇属的Arc mRNA序列。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的组合物，其中所述Arc mRNA包括与SEQ IDNO:9-12中的任一个具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
24.一种重组系统，其包括编码载荷mRNA的DNA，所述载荷mRNA包括Arc Arc 5’UTR序列。
25.根据权利要求24所述的系统，其进一步包括编码Arc mRNA的第二DNA。
26.根据权利要求24或25所述的系统，其中所述Arc 5’UTR序列包括来自哺乳动物的Arc 5’UTR序列。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的系统，其中所述Arc 5’UTR序列包括来自人、小鼠或大鼠的Arc 5’UTR序列。
28.根据权利要求24或25所述的系统，其中所述Arc 5’UTR序列包括来自果蝇属的Arc5’UTR序列。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的系统，其中所述Arc 5’UTR序列包括与SEQ IDNO:1-4中的任一个具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种rna转录物组合物，其包含载荷mrna(cargo mrna)，所述载荷mrna包括arc 5’utr序列。
2.根据权利要求1所述的rna转录物组合物，其进一步包含arc mrna。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述arc 5’utr序列包括来自哺乳动物的arc5’utr序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述arc 5’utr序列包括来自人、小鼠或大鼠的arc 5’utr序列。
5.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述arc 5’utr序列包括来自果蝇属(drosophila)的arc 5’utr序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述arc 5’utr序列包括与seq idno:1-4中的任一个具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述载荷mrna进一步包括poly(a)信号。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述载荷mrna编码治疗性蛋白。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述载荷mrna编码肽、酶、细胞因子、激素、生长因子、抗原、抗体、抗体的一部分、凝血因子、调节蛋白、信号传导蛋白、转录蛋白和/或受体。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述载荷mrna编码荧光蛋白、生物发光蛋白和/或重组酶报告子(recombinase reporter)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述arc mrna包括arc 3’utr序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述arc mrna包括来自哺乳动物的arc 3’utr序列。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述哺乳动物是人、小鼠或大鼠。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述arc 3’utr序列包括来自果蝇属的arc 3’utr序列。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的组合物，其中所述arc 3’utr序列包括与seqid no:5-8中的任一个具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述arc mrna进一步包括poly(a)信号。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述arc mrna编码来自哺乳动物的arc蛋白。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述哺乳动物是人、小鼠或大鼠。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述arc mrna编码来自果蝇属的arc蛋白。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述arc mrna包括来自哺乳动物的arc mrna序列。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述哺乳动物是人、小鼠或大鼠。
22.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述arc mrna包括来自果蝇属的arc mrna序列。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的组合物，其中所述arc mrna包括与seq idno:9-12中的任一个具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
24.一种重组系统，其包括编码载荷mrna的dna，所述载荷mrna包括arc arc 5’utr序列。
25.根据权利要求24所述的系统，其进一步包括编码arc mrna的第二dna。
26.根据权利要求24或25所述的系统，其中所述arc 5’utr序列包括来自哺乳动物的arc 5’utr序列。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的系统，其中所述arc 5’utr序列包括来自人、小鼠或大鼠的arc 5’utr序列。
28.根据权利要求24或25所述的系统，其中所述arc 5’utr序列包括来自果蝇属的arc5’utr序列。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的系统，其中所述arc 5’utr序列包括与seq idno:1-4中的任一个具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的序列。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的系统，其中所述载荷mrna进一步包括poly(a)信号。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的系统，其中所述载荷mrna编码治疗性蛋白。
32.根据权利要求24至30中任一项所述的系统，其中所述载荷mrna编码肽、酶、细胞因子、激素、生长因子、抗原、抗体、抗体的一部分、凝血因子、调节蛋白、信号传导蛋白、转录蛋白和/或受体。
33.根据权利要求24至30中任一项所述的系统，其中所述载荷mrna编码荧光蛋白、生物发光蛋白和/或重组酶报告子。
34.根据权利要求24至33中任一项所述的系统，其中所述arc mrna包括arc 3’utr序列。
35.根据权利要求24至34中任一项所述的系统，其中所述arc 3’utr序列包括来自哺乳动物的arc 3’utr序列。
36.根据权利要求24至35中任一项所述的系统，其中所述arc 3’utr序列包括选自人、小鼠或大鼠的arc 3’utr序列。
37.根据权利要求24至33中任一项所述的系统，其中所述arc 3’utr序列包括来自果蝇属的arc 3’utr序列。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的系统，其中所述arc 3’utr序列包括与seq idno:5-8中的任一个具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的序列。
39.根据权利要求24至38中任一项所述的系统，其中所述arc mrna进一步包括poly(a)信号。
40.根据权利要求24至39中任一项所述的系统，其中所述系统包括单一质粒，所述单一质粒包括编码具有arc 5’utr序列的载荷mrna的所述dna和编码arc mrna的所述第二dna。
41.根据权利要求24至39中任一项所述的系统，其中所述系统包括：
42.根据权利要求40至41中任一项所述的系统，其中所述质粒进一步包括异源dna调节元件。
43.根据权利要求42所述的系统，其中所述异源dna调节元件包括启动子、增强子、沉默子、绝缘子或其组合。
44.根据权利要求24至43中任一项所述的系统，其中所述arc mrna包括来自哺乳动物的arc mrna序列。
45.根据权利要求44所述的系统，其中所述哺乳动物是人、小鼠或大鼠。
46.根据权利要求24至43中任一项所述的系统，其中所述arc mrna包括来自果蝇属的arc mrna序列。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的系统，其中所述arc 5’utr序列包括与seq idno:1-4中的任一个具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
48.根据权利要求24至47中任一项所述的系统，其中所述arc mrna编码来自哺乳动物的arc蛋白。
49.根据权利要求48所述的系统，其中所述哺乳动物是人、小鼠或大鼠。
50.根据权利要求24至47中任一项所述的系统，其中所述arc mrna编码...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·江，W·顾，S·罗中，Z·袁，
申请(专利权)人：康奈尔大学，
类型：发明
国别省市：
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